Biotechnologie

Introduction

Le transfert de Southern est l’une des techniques centrales en biologie moléculaire. D’abord mis au point par E M Southern (1975), le transfert de Southern a pour résultat le transfert de molécules d’ADN, habituellement des fragments de restriction, d’un gel d’électrophorèse à une feuille de nitrocellulose ou de nylon, de telle sorte que le motif de  la bande d’ADN présent dans le gel est reproduit sur la membrane. Au cours du transfert ou à la suite d’un traitement ultérieur, l’ADN devient immobilisé sur la membrane et peut être utilisé comme substrat pour l’analyse d’hybridation avec des sondes d’ADN ou d’ARN marquées ciblant spécifiquement des fragments de restriction individuels dans l’ADN transféré. Essentiellement, le transfert de Southern est donc une méthode de «détection d’un fragment de restriction spécifique sur fond de nombreux autres fragments de restriction».

L’ADN restreint pourrait être un plasmide ou un clone de bactériophage, le transfert de Southern étant utilisé pour confirmer l’identité d’un fragment cloné ou pour identifier un sous-fragment intéressant à partir de l’ADN cloné, ou d’ADN génomique. Et dans ce cas, ça sera une préparation pour des techniques telles que l’analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction.

Dans cet article, les principes généraux du transfert de Southern sont décrits, suivis d’un survol des méthodologies utilisées pour la préparation de l’ADN avant transfert, le transfert lui-même et l’analyse de l’hybridation. L’article se terminera par une étude des applications et des limites du transfert de Southern. Le principe du transfert de Southern, l’aptitude de la poudre ou des feuilles de nitrocellulose à se lier à l’ADN étaient connue depuis de nombreuses années et a été utilisée dans les années 1950 et 1960 dans divers types d’études d’hybridation d’acides nucléiques. Dans ces premières techniques, l’ADN immobilisé était non fractionné, consistant simplement en un ADN total lié à la poudre de nitrocellulose ou déposé sur une feuille de nitrocellulose. L’introduction au début des années 1970 de méthodes d’électrophorèse sur gel permettant de séparer les fragments de restriction de l’ADN en fonction de leur taille a conduit au développement de techniques de transfert en masse de fragments séparés du gel au support de nitrocellulose. La procédure décrite par Southern (1975), impliquant un transfert capillaire de l’ADN du gel vers une feuille de nitrocellulose placée au-dessus, était simple et efficace et bien qu’embellie au fil des ans, cette procédure originale diffère légèrement de la méthode de routine encore utilisée dans de nombreux laboratoires de biologie moléculaire. La méthode originale pour le transfert de Southern est illustrée sur la figure ci-dessous.

Une  électrophorèse sur gel d’agarose contenant les fragments de restriction fractionnées, est placé sur une mèche de papier filtre qui forme une connexion entre le gel et un réservoir de tampon à haute teneur en sel. Une membrane est placée sur le dessus du gel et recouverte d’une tour de serviettes en papier qui sont maintenues en place avec un poids. L’action capillaire a pour effet de faire tremper le tampon dans la mèche, le gel et la membrane du papier filtre et dans les serviettes en papier. Lorsque le tampon traverse le gel, les fragments d’ADN sont transportés avec celui-ci dans la membrane, où ils sont liés à la nitrocellulose. Le transfert efficace de fragments jusqu’à 15 kb de longueur dure environ 18 h, ce qui équivaut à peu près à toute une «nuit». La seule complication de la technique est la possibilité que le tampon contourne le gel en trempant directement de la mèche vers les serviettes en papier, ce qui est peu probable si l’installation est soigneusement assemblée. Des modifications plus récentes apportées au transfert de Southern sont présentées sur le schémas ci-dessous:

L’amélioration majeure a été l’introduction de membrane en nylon, qui présente trois avantages par rapport à la membrane en nitrocellulose :

1/ Les membranes de nylon sont moins fragiles que les feuilles de nitrocellulose, ces dernières tendent à se fissurer lorsqu’elles ne sont pas manipulées avec doigté  pendant le transfert de Southern et se désintègrent généralement si l’on tente d’effectuer plus de deux ou trois analyses d’hybridation avec la même feuille. Les membranes en nylon ne peuvent pas être endommagées par la manipulation et une seule membrane peut être réhybridée jusqu’à dix fois, cette limite étant due non à une rupture éventuelle de la membrane mais à la perte progressive de l’ADN transféré lors d’hybridations répétées.

2/ Le second avantage des membranes de nylon est que, dans certaines conditions (une membrane chargée positivement et un tampon de transfert alcalin), l’ADN transféré se lie de manière covalente à la membrane pendant le processus de transfert. Ce n’est pas le cas avec une membrane de nitrocellulose, qui lie initialement l’ADN de manière semi-permanente, l’immobilisation se produisant seulement lorsque la membrane est cuite à 80°C. Le transfert sur une membrane de nylon chargée positivement peut donc réduire la perte possible d’ADN qui pourrait se produire par lessivage à travers la membrane pendant le processus de transfert, il est également plus rapide, le temps de transfert étant réduit de 18 h à 2 h.

3/ Enfin, les membranes de nylon lient efficacement les fragments d’ADN jusqu’à 50 pb de longueur, alors que les membranes de nitrocellulose ne sont efficaces qu’avec des molécules de plus de 500 pb. La nitrocellulose n’a cependant pas été complètement remplacée car elle présente un avantage significatif par rapport aux membranes de nylon: une quantité réduite d’hybridation de fond, en particulier avec des sondes qui ont été marquées avec des marqueurs non radioactifs.

D’autres modifications ont été apportées à la procédure originale de transfert de Southern pour accélérer et améliorer l’efficacité du transfert. Des modifications de l’architecture du système de transfert capillaire ont été proposées, mais  ces procédés alternatifs sont plus compliqués à mettre en place que le simple transfert vers le haut représenté sur la figure ci-dessus et aucun n’offre une amélioration majeure de la vitesse ou de l’efficacité. Des améliorations peuvent cependant être obtenues en utilisant une méthode de transfert non capillaire, telle qu’un électro-transfert, qui utilise une électrophorèse pour déplacer l’ADN du gel vers la membrane. Cette technique a été initialement développée pour le transfert de gels de polyacrylamide, dont les tailles de pores sont trop petites pour un transfert capillaire efficace de l’ADN, et a également été appliquée à des gels d’agarose .

 

L’électro-transfert est plus rapide que le transfert capillaire mais, doit être effectué avec précaution car des problèmes peuvent survenir avec la formation de bulles si le gel devient trop chaud pendant le transfert. Le Transfert sous vide est un choix plus populaire pour les gels d’agarose, une pression de vide étant utilisée pour entraîner le tampon à travers le gel et la membrane plus rapidement que par simple action capillaire, ce qui permet de réduire le temps de transfert à 30 minutes. On a également tenté de se dispenser entièrement du transfert de Southern et d’effectuer une analyse d’hybridation directement avec le gel d’électrophorèse, l’immobilisation de l’ADN étant obtenue en séchant le gel de sorte que l’ADN soit piégé dans la matrice de gel déshydratée ou lié à un support solide sur lequel le gel est placé avant le séchage. Ces techniques se sont avérées utiles pour certaines applications mais, souffrent de signaux de fond élevés après l’analyse d’hybridation.

Préparation de l’ADN avant le transfert de Southern :

Préparation de l’ ADN génomique :

Les techniques utilisées pour préparer l’ADN pour le transfert de Southern dépendent du type d’ADN étudié. Pour l’ADN génomique, l’objectif est d’obtenir des molécules qui ne sont pas devenues fragmentées de façon extensive par cisaillement aléatoire au cours du processus d’extraction, de sorte que des fragments de restriction spécifiques de 20 kb et plus puissent être obtenus. Les cellules doivent donc être brisées dans des conditions relativement douces. Pour les cellules de culture tissulaire et les échantillons sanguins, l’incubation dans un tampon contenant un détergent tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS) est généralement suffisante pour rompre les membranes cellulaires et libérer l’ADN de masse moléculaire élevée. Les bactéries, qui sont entourées par une paroi cellulaire, peuvent être cassées en douceur par traitement avec une combinaison de lysozyme et d’éthylène-diamine-tétra-acétate (EDTA).

Le lysozyme est une enzyme qui dégrade certains des composés polymères présents dans la paroi cellulaire bactérienne et l’EDTA chélate les ions magnésium qui sont requis pour l’intégrité de la structure polymère. L’addition subséquente d’un détergent provoque l’éclatement des cellules. Les cellules végétales sont généralement brisées par le broyage physique de tissus qui ont été congelés dans de l’azote liquide. Cela provoque une certaine fragmentation de l’ADN mais fournit un rendement beaucoup plus élevé. Après la rupture cellulaire, les procédures d’extraction de l’ADN génomique se poursuivent avec des étapes visant à éliminer les principaux produits biochimiques autres que l’ADN présent dans l’extrait initial. Une protéase telle que la protéinase K pourrait être incluse dans le tampon utilisé pour la rupture cellulaire, afin de commencer la dégradation des protéines dans l’extrait, mais la déprotéinisation est habituellement réalisée par extraction au phénol, addition de phénol ou mélange 1:1 du phénol et du chloroforme entraînant la précipitation des protéines. Après centrifugation, les protéines précipitées migrent vers l’interface entre les phases organique et aqueuse, tandis que les acides nucléiques restent dans la phase aqueuse.

Pour les extraits de plantes, qui contiennent des quantités plus importantes de glucides que celles trouvées dans la plupart des cellules animales et microbiennes, une purification supplémentaire impliquant le détergent bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) est fréquemment utilisée. Ce composé se lie spécifiquement aux acides nucléiques, améliorant leur récupération lors de l’extraction du phénol. La plupart des procédures d’extraction comprennent également la digestion de l’ARN avec de la ribonucléase et un traitement final avec de l’éthanol, qui précipite les polymères d’acide nucléique restants, ce qui permet d’éliminer les ribonucléotides et autres contaminants de faibles poids moléculaires. L’ADN précipité est séché puis redissous dans de l’eau ou un tampon Tris-EDTA.

Préparation de l’ADN Plasmidique ou Phagique :

Des techniques spéciales doivent être utilisées si l’objectif est d’obtenir de l’ADN plasmidique ou celui du bactériophage à partir de clones bactériens. L’ADN plasmidique peut être obtenu par l’une quelconque des plusieurs techniques qui exploitent les différences physiques entre les plasmides et l’ADN génomique bactérien, les plasmides étant de petites molécules sur-enroulées alors que l’ADN génomique, après rupture cellulaire, est présent sous forme de longs fragments linéaires. Une méthode populaire implique le traitement de l’extrait cellulaire avec de l’alcali, qui précipite l’ADN linéaire mais laisse des plasmides super-enroulés en solution. L’ADN du bactériophage, par exemple les vecteurs recombinants l ou M13, sont habituellement obtenus directement à partir de particules de bactériophage sécrétées par des bactéries infectées, le procédé de purification étant simplifié par le fait que ces particules sont constituées uniquement d’ADN et de protéines.

Les techniques de transfert d’ADN:

Après que l’ADN purifié ait été traité avec une ou plusieurs endonucléases de restriction, il est fractionné par électrophorèse sur gel d’agarose et le gel est ensuite pré-traité avant la mise en place du transfert de Southern. Le prétraitement a deux objectifs:

Tout d’abord, il est souhaitable de briser les molécules d’ADN dans les bandes individuelles dans le gel en plus petits fragments, parce que les plus petits fragments sont transférés plus rapidement que les plus grands. Ceci est réalisé en trempant le gel dans 0,25 mol/lit de HCl pendant 30 min, ce qui entraîne une petite quantité de dépurination – clivage de la liaison bN-glycosidique entre les bases puriques (adénine ou guanine) et le composant sucre de leurs nucléotides – qui est suivie par la décomposition de la structure du sucre et la rupture de la chaîne polynucléotidique.

Le deuxième prétraitement est avec une solution alcaline qui dénature les molécules d’ADN double brin par rupture de leurs liaisons hydrogène, de sorte que les molécules deviennent simple brin. Cela facilite leur transfert et leur liaison subséquente à la membrane, et garantit également qu’après la liaison, les composants d’appariement de bases des polynucléotides sont disponibles pour l’hybridation avec la sonde. Si une membrane de nitrocellulose est utilisée, le prétraitement alcalin est suivi d’une neutralisation du gel par trempage dans un tampon Tris-sel, cette étape étant essentielle car l’ADN ne se lie pas à la nitrocellulose à un pH supérieur à 9,0. Le transfert de Southern est ensuite mis en place, comme illustré sur la figure 1, avec un tampon de transfert à haute teneur en sel, habituellement la formulation appelée ’20x SSC ‘, qui comprend (sel) et 0,3 mol de citrate de sodium . Le même tampon peut être utilisé pour le transfert sur une membrane de nylon, mais avec une membrane de nylon chargée positivement, un tampon de transfert alcalin   est utilisé car, comme décrit précédemment, ceci entraîne une fixation covalente immédiate de l’ADN transféré à la membrane. Avec ce type de transfert, le prétraitement alcalin est inutile. Le transfert est ensuite laissé pendant au moins 18 heures pour un transfert à teneur élevée en sel, ou 2 heures pour un transfert alcalin. Après le transfert, le montage de transfert est démonté et la membrane est rincée à 2x SSC et laissé sécher. Si la tache a été faite sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon non chargée, alors l’ADN n’est que faiblement lié à la membrane à ce stade. Une immobilisation plus permanente doit donc être réalisée soit par cuisson à 80°C pendant 2 h, ce qui entraîne une fixation non covalente mais semi-permanente de l’ADN sur une membrane de nitrocellulose, soit une irradiation UV qui entraîne une fixation covalente de l’ADN sur une membrane de nylon.

Hybridation d’ADN/ADN:

L’analyse d’hybridation est basée sur le principe que deux polynucléotides formeront un hybride stable par appariement de bases si leurs séquences nucléotidiques sont totalement ou partiellement complémentaires. Un fragment de restriction spécifique dans un transfert de Southern peut donc être détecté si la membrane est sondée avec une seconde molécule d’ADN marquée qui a la même séquence, ou une séquence similaire, que le fragment recherché. Nous étudierons les types de sondes d’hybridation qui peuvent être utilisées plus tard; Nous allons d’abord étudier la méthodologie utilisée pour l’analyse d’hybridation.

Préhybridation d’un transfert de Southern:

L’analyse d’hybridation est effectuée en trempant le Southern blot dans un tampon contenant la sonde d’hybridation, habituellement dans un tube qui est constamment tourné de sorte que toutes les parties de la membrane sont exposées à la sonde, ou alternativement dans un sac en plastique scellé et placé sur un agitateur. L’hybridation est réalisée en deux étapes:

1/ Premièrement, la membrane est préhybridée dans une solution conçue pour bloquer les sites de liaison d’ADN non utilisés sur la surface de la membrane. Si cette étape est omise alors la sonde se liera de manière non spécifique à la surface de la membrane et le signal résultant de l’hybridation au fragment de restriction spécifique sera difficile sinon impossible à identifier. La solution de préhybridation contient donc des composés polymères non biologiques tels que la polyvinylpyrrolidone et/ou des polymères biologiques tels que le Ficoll (composé à base de carbohydrate), la sérumalbumine bovine ou le lait en poudre. L’ADN d’un organisme non apparenté à celui dont l’ADN va être hybridé peut également être utilisé (l’ADN du sperme de saumon est un choix populaire). La préhybridation prend entre 15 min et 3 h à 688C, selon le type de membrane.

The hybridization and washing steps :

2/ La deuxième étape est l’hybridation réelle, qui est effectuée dans un tampon riche en sel contenant un détergent, généralement 2 x SSC + 1% SDS. Deux problèmes sont critiques à ce stade de l’expérience. D’abord, suffisamment d’ADN sonde doit s’hybrider au fragment de restriction cible pour produire un signal clair qui peut être discerné par le système de détection approprié pour le marqueur porté par la sonde. Pour les applications les plus exigeantes comme la détection d’un gène simple copie dans l’ADN génomique humain, atteindre une sensibilité suffisante pourrait poser problème même si la quantité maximale d’ADN génomique est chargée sur le gel d’électrophorèse (en pratique, environ 10 µg d’ADN par voie ) et la sonde a été marquée à son activité spécifique maximale (> 1000000000 dpm/µg  pour un marqueur radioactif P32). Des problèmes de plus en plus grands seront rencontrés si un élément radioactif autre que P32 est utilisée, comme S35, qui est généralement appropriée seulement pour sonder des ADN moins complexes tels que des clones plasmidiques ou bactériophages restreints, ou si une sonde non radioactive est utilisée. Dans ces circonstances, une certaine augmentation de la sensibilité peut être obtenue en incluant un polymère inerte tel que 10% de sulfate de dextrane ou 8% de polyéthylèneglycol 6000 dans la solution d’hybridation. On pense que ces polymères induisent les molécules de sonde à former des réseaux de sorte que de plus grandes quantités d’ADN s’hybrident aux sites cibles sur la membrane. En pratique, une augmentation de sensibilité de 10 à 100 fois peut être obtenue (Amasino, 1986). Le deuxième facteur critique à prendre en compte lors de l’étape d’hybridation est la spécificité de la réaction. Si l’ADN sonde a été soigneusement choisi, il contiendra une région qui est complètement complémentaire de tout ou partie du fragment de restriction  recherché. Si cette région d’hybridation dans la sonde n’est pas complètement complémentaire de la cible, alors elle aura au moins une région de forte similarité de sorte qu’un hybride stable puisse se former. Le problème est que la sonde a également le potentiel de s’hybrider à tout autre fragment d’ADN transféré avec lequel elle présente une complémentarité partielle.

L’expérience d’hybridation ne donnera jamais un signal non ambigu si la sonde est plus proche d’un second fragment de restriction que de celui recherché, mais des problèmes d’hybridation non spécifique peuvent toujours survenir même si la meilleure correspondance est avec la cible spécifique. Cela signifie que l’étape d’hybridation doit être effectuée à une  rigueur qui entraîne la stabilité de l’hybride sonde-cible spécifique alors que tous les autres hybrides sont instables, la rigueur étant déterminée par la composition du tampon d’hybridation et la température à laquelle l’expérience est réalisée. La composition du tampon est pertinente car la stabilité de l’hybride dépend de la force ionique et de la présence d’agents déstabilisants, tels que le formamide, qui perturbent les liaisons hydrogène. La température est pertinente parce que la température de fusion ( la température la plus élevée à laquelle l’hybride est stable) d’un hybride base-base complètement formé  est plus élevée que celle pour certaines paires de bases  qui ne sont pas complètement  formées parce que la sonde et les ADN cibles ne sont pas totalement complémentaires. La formation de l’hybride désiré, et la déstabilisation d’hybrides non spécifiques, peuvent donc être réalisées en utilisant une combinaison appropriée de composition de tampon et de température d’hybridation. Un certain nombre de stratégies différentes sont possibles. Si la sonde a une longueur de 4100 bp, par exemple avec un fragment de restriction clonée, l’hybridation initiale est habituellement réalisée à 688 °C dans un tampon à haute teneur en sel, ce qui représente des conditions très strictes dans lesquelles seuls des hybrides stables peuvent se former avec très peu ou pas d’hybridation non spécifique. Avec cette stratégie, les étapes de lavage qui sont effectuées après hybridation sont conçues simplement pour retirer la sonde non hybridée.

Cependant, si une courte sonde oligonucléotidique est utilisée (15-25 nucléotides de longueur), alors l’étape d’hybridation est habituellement effectuée dans des conditions de rigueur faible  (typiquement à une température de plusieurs degrés inférieure à la Tm calculée pour l’hybride désiré). Tous les hybrides potentiels, y compris les hybrides non spécifiques, sont capables de se former. La spécificité est ensuite atteinte par une série de lavages à des températures croissantes, de sorte que, espérons-le, seul l’hybride désiré reste à la fin de la procédure. Après lavage, la membrane est soumise à la procédure de détection appropriée à la sonde utilisée, par exemple autoradiographie pour une sonde radioactive. Une ré-observation subséquente est possible si la membrane est « retirée » par lavage dans un tampon à haute température contenant un alcali et un détergent pour déstabiliser l’ADN hybridé. Cette procédure n’est jamais entièrement satisfaisante car il est difficile d’éviter d’enlever une partie de l’ADN en même temps, de sorte que même les membranes de nylon portant un ADN lié de manière covalente ne peuvent être réprimées qu’une dizaine de fois.

Les types de sondes d’hybridation:

Any DNA molecule that is complementary to the restriction fragment being sought can be used as the probe. Depending on the application (see below),the probe might itself be a restriction fragment,or it might be a DNA molecule obtained by the polymerase chain reaction (PCR),or a cDNA prepared by complementary DNA synthesis from an mRNA template. Synthetic oligonucleotides are also frequently used as hybridization probes, especially when discrimination between very similar target DNAs is required. This is because oligonucleotides of 15– 25 nucleotides in length form hybrids whose melting temperatures can be estimated from the formula: Tm 5 (2
number of A and T nucleotides) 1 (4
number of G and C nucleotides) 8C The Tm values for most 15–25mer oligonucleotides fall between 40 and 908C. A single nonbase-paired nucleotide position in the hybrid between the oligonucleotide probe and target DNA can reduce the Tm by 3–58C,so careful control of the posthybridization wash temperature can distinguish a target site that is completely complementary to the probe from one that differs at just a single nucleotide position,enabling highly specific probing to be carried out. A second popular type of hybridization probe is one made of RNA rather than DNA. RNA probes have a number of advantages compared with their DNA counterparts,the most important of which in practical terms is the availability of methods for synthesis in the test tube of large amounts of an RNA probe from a DNA molecule that has been cloned adjacent to a promoter for a bacteriophage RNA polymerase. Starting with 1 mg of cloned DNA, purified T7 RNA polymerase,for example,can make up to 30 mg of RNA in 30 min,this RNA being labelled with a specific activity of over 109 dpm mg 2 1 if a 32P-labelled ribonucleotide is included in the reaction mixture. RNA probes also have the advantage of being single-stranded, which means that the effective probe concentration does not decline during the hybridization,as happens with a double-stranded DNA probe due to base-pairing of the two complementary probe molecules to one another.

Applications and Limitations of Southern Blotting

The applications of Southern blotting are diverse and are not easily summarized in a short article. Two examples will suffice to illustrate the range of research questions to which the technique can be applied.

Southern blotting in clone identification

The commonest applications of Southern blotting occur during projects aimed at identification and cloning of a specified gene. Southern blotting of genomic DNA is used to identify one or more restriction fragments that contain the gene being sought and,after cloning and tentative identification of the desired recombinant by colony or plaque hybridization probing,Southern blotting of restricted clone DNA is used to confirm the clone identification and possibly to locate a shorter restriction fragment, containing the sequence of interest,from within the cloned DNA. The latter application is important because the interesting gene sequence might be just a few kb in length but contained initially in a genomic clone of several hundred kb prepared with a high-capacity vector such as a bacterial or yeast artificial chromosome. For Southern blotting to be applicable to gene identification it is of course necessary to have a suitable hybridization probe,one that will detect specifically the one or more restriction fragments that contain the gene being sought. Often the gene will have already been cloned as a cDNA that can be used as a probe for identification of the genomic version of the gene. Alternatively,if the gene has been cloned from a related organism,one in which the gene sequence is likely to be similar to that in the organism now being studied, then heterologous probing can be used,in which some noncomplementarity between probe and target is tolerated during the hybridization step. This approach can be used, for example,to identify homologues of human genes in the genomes of other primates,and can even be used across broad species barriers,for example by using Drosophila genes as probes for related human sequences. Another possibility is to use the amino acid sequence of the protein coded by the desired gene to design a mixed oligonucleotide probe,one that consists of a variety of related sequences that together include all the combinations that would code for a short segment of the amino acid sequence. For example,the mixed oligonucleotide 5’-AA(C/U)GA(A/ G)AUGUU(C/U)UGGUA(C/U)GG-3’,which contains sixteen different sequences,covers all possibilities for the amino acid sequence asparagine-glutamine-methioninephenylalanine-tryptophan-tyrosine-glycine and would be expected to detect the DNA sequence coding for this protein segment when used at a sufficiently high stringency in a Southern hybridization experiment. Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net 5

Restriction fragment length polymorphism analysis

The second major application of Southern hybridization is in the technique called restriction fragment length polymorphism (RFLP) mapping,which is important in construction of genome maps (Brown,1999). Treatment of genomic DNA from different individuals with a single restriction enzyme does not always give the same set of fragments because some restriction sites are polymorphic, being present in some individuals but absent in others, usually because a point change in the nucleotide sequence changes the restriction site into a sequence not recognized by the restriction enzyme. These polymorphic sites can be used as markers in genetic mapping and were of considerable importance in construction of the first comprehensive human maps (Donis-Keller et al.,1987),there being about 105 RFLPs in the human genome. RFLPs are typed by Southern blotting as shown in Figure 2,the probe being a DNA fragment that spans the polymorphic region (possibly one of the polymorphic fragments,possibly a fragment prepared by cutting the DNA with a different restriction enzyme,or possibly a fragment obtained by PCR) and the presence or absence of the polymorphic site determined from the size(s) of the restriction fragment(s) detected after Southern blotting.

Summary

Southern blotting is a technique that enables a specific restriction fragment to be detected against a background of many other restriction fragments. It involves transfer of DNA fragments from an electrophoresis gel to a nitrocellulose or nylon membrane in such a way that the DNA banding pattern present in the gel is reproduced on the membrane. Hybridization probing is then used to detect the restriction fragment that is being sought. The basic methodology for Southern blotting has not changed since the original technique was described in 1975,but modifications have been introduced with the aim of speeding up the process and achieving a more efficient transfer. Southern blotting has many applications in molecular biology, including the identification of one or more restriction fragments that contain a gene or other DNA sequence of interest,and in the detection of RFLPs used in construction of genomic maps.

 

Les enzymes agissant sur l’ADN peuvent être regroupées en quatre grandes classes, en fonction du type de réaction qu’elles catalysent:

1) Les nucléases sont des enzymes qui coupent, raccourcissent ou dégradent les molécules d’acide nucléique.

2) Les ligases rejoignent les molécules d’acide nucléique.

3) Les polymérases produisent des copies des molécules.

4) Les enzymes modificatrices éliminent ou ajoutent des groupes chimiques sur l’ADN.

Avant d’examiner en détail chacune de ces classes d’enzymes, deux points doivent être signalés. La première est que, bien que la plupart des enzymes peuvent être assignés à une classe particulière, quelques-uns affichent des activités multiples qui s’étendent sur deux ou plusieurs classes. Plus important encore, de nombreuses polymérases combinent leur capacité à fabriquer de nouvelles molécules d’ADN avec une activité de dégradation de l’ADN associée (exemple, la nucléase).
Deuxièmement, il convient de noter qu’il existe de nombreuses enzymes similaires qui sont capables d’agir sur l’ARN. La ribonucléase utilisée pour éliminer l’ARN contaminant des préparations d’ADN en est un exemple. Bien que certaines enzymes agissant sur l’ARN aient des applications dans le clonage de gènes et seront mentionnées dans des chapitres ultérieurs, nous limiterons en général nos applications aux enzymes qui agissent sur l’ADN.

La principale distinction entre les différentes exonucléases réside dans le nombre de brins qui sont dégradés lorsqu’une molécule double brin est attaquée. L’enzyme appelée Bal31 (purifiée à partir de la bactérie Alteromonas espejiana) est un exemple d’exonucléase qui élimine les nucléotides des deux brins d’une molécule double brin. Plus la période de temps pendant laquelle Bal31 est autorisé à agir sur un groupe de molécules d’ADN, plus les fragments d’ADN résultant seront courts.

Le même critère peut être utilisé pour classer les endonucléases. L’endonucléase S1 (du champignon Aspergillus oryzae) ne clive que des brins simples, tandis que la désoxyribonucléase I (DNase I), préparée à partir de pancréas de vache, coupe les molécules simples et bicaténaires.

Les Nucléases :

Les nucléases dégradent les molécules d’ADN en brisant les liaisons phosphodiester qui lient un nucléotide à l’autre dans un brin d’ADN. Il existe deux types différents de nucléases :

1) Les exonucléases éliminent les nucléotides l’un après l’autre de l’extrémité d’une molécule d’ADN. 

2) Les endonucléases sont capables de rompre les liaisons phosphodiester internes au sein d’une molécule d’ADN. 

 

La principale distinction entre les différentes exonucléases réside dans le nombre de brins qui se dégradent lorsqu’une molécule double brin est attaquée. L’enzyme appelée Bal31 (purifiée à partir de la bactérie Alteromonas espejiana) est un exemple d’exonucléase qui élimine les nucléotides des deux brins d’une molécule double brin. Plus la période de temps pendant laquelle Bal31 est autorisé à agir sur un groupe de molécules d’ADN, plus les fragments d’ADN résultant seront courts.

En revanche, des enzymes telles que l’exonucléase III de E. coli dégradent seulement un brin d’une molécule double brin, laissant l’ADN monocaténaire comme produit.

Le même critère peut être utilisé pour classer les endonucléases. L’endonucléase S1 (du champignon Aspergillus oryzae) ne clive que des brins simples.

Et la désoxyribonucléase I (DNase I), préparée à partir de pancréas de vache, coupe les molécules simples et bicaténaires . La DNase I est non spécifique en ce qu’elle attaque l’ADN à n’importe quelle liaison phosphodiester interne, de sorte que le résultat final de l’action prologée de la DNase I est un mélange de mononucléotides et d’oligonucléotides très courts. Tandis que le groupe spécial d’enzymes appelées endonucléases de restriction ne clivent l’ADN double caténaire que sur un nombre limité de sites de reconnaissance spécifiques . Ces enzymes importantes sont décrites en détail dans un autre chapitre.

Les ligases :

Dans la cellule, la fonction de l’ADN ligase est de réparer les ruptures monocaténaires (« discontinuités ») qui surviennent dans des molécules d’ADN double brin pendant, par exemple, la réplication de l’ADN. Les ADN ligases de la plupart des organismes peuvent également recoller deux fragments individuels d’ADN double brin.

Les polymerases :

Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent un nouveau brin d’ADN complémentaire à un modèle d’ADN ou d’ARN existant. La plupart des polymérases ne peuvent fonctionner que si le gabarit possède une région à double brin qui sert d’amorce pour l’initiation de la polymérisation. Quatre types d’ADN polymérase sont utilisés couramment dans le génie génétique.

La première est l’ADN polymérase I, qui est habituellement préparée à partir d’ E. Coli. Cette enzyme s’attache à une courte région monocaténaire (ou entaille ) dans une molécule d’ADN principalement à double brin, puis synthétise un brin complètement nouveau, dégradant le brin existant à mesure qu’il progresse. L’ADN polymérase I est donc un exemple d’une enzyme avec une double activité, la polymérisation de l’ADN et la dégradation de l’ADN. Les activités de polymérase et de nucléase de l’ADN polymérase I sont contrôlées par différentes parties de la molécule d’enzyme.

L’activité nucléase est contenue dans les premiers 323 acides aminés du polypeptide, si bien que l’élimination de ce segment laisse une enzyme modifiée qui conserve la fonction polymérase mais est incapable de dégrader l’ADN. Cette enzyme modifiée, appelée fragment de Klenow, peut encore synthétiser un brin d’ADN complémentaire sur un modèle monocaténaire, mais comme il n’a pas d’activité nucléase, il ne peut pas poursuivre la synthèse une fois l’entaille rempli. Plusieurs autres enzymes, polymérases naturelles et des versions modifiées  ont des propriétés similaires au fragment de Klenow. L’application principale de ces polymérases est dans le séquençage de l’ADN.

 

 

L’ADN polymérase Taq utilisée dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est l’enzyme ADN polymérase I de la bactérie Thermus aquaticus. Cet organisme vit dans les sources chaudes, et beaucoup de ses enzymes, y compris l’ADN polymérase Taq, sont thermostables, ce qui signifie qu’ils sont résistants à la dénaturation par traitement thermique. C’est la particularité de Taq ADN polymérase qui la rend appropriée pour la PCR, car s’il n’était pas thermostable il serait inactivé lorsque la température de la réaction est élevée à 94 °C pour dénaturer l’ADN.

Le dernier type d’ADN polymérase qui est important dans le génie génétique est la transcriptase inverse, une enzyme impliquée dans la réplication de plusieurs types de virus. La transcriptase inverse est unique en ce qu’elle utilise comme modèle non l’ADN mais l’ARN. La capacité de cette enzyme à synthétiser un brin d’ADN complémentaire à un gabarit d’ARN est centrale à la technique appelée clonage d’ADN complémentaire (ADNc).

Les enzymes modifiant l’ADN :

Il existe de nombreuses enzymes qui modifient les molécules d’ADN par addition ou élimination de groupes chimiques spécifiques. Les plus importantes sont les suivantes:
(A) phosphatase alcaline: (à partir de E. coli, tissu intestinal de veau ou crevette arctique), élimine le groupe phosphate présent à l’extrémité 5 ‘d’une molécule d’ADN. (B) Polynucleotide kinase: (provenant de E. coli infectée par le phage T4), qui a l’effet inverse de la phosphatase alcaline, ajoutant des groupes phosphate sur des terminaisons 5 ‘libres.
(C) Terminal désoxynucléotidyl transférase: (à partir de tissu de thymus de veau), ajoute un ou plusieurs désoxyribonucléotides sur l’extrémité 3 ‘d’une molécule d’ADN.

Enzymes pour la coupe de l’ADN : des endonucléases de restriction .

Le clonage de gènes nécessite que les molécules d’ADN soient coupées d’une manière très précise et reproductible. Ceci est illustré par la façon dont le vecteur est coupé pendant la construction d’une molécule d’ADN recombinant. Chaque molécule de vecteur doit être clivée en une seule position, pour ouvrir le cercle de sorte qu’un nouvel ADN puisse être inséré: une molécule qui est coupée plus d’une fois sera cassée en deux ou plusieurs fragments séparés et ne sera d’aucune utilité comme vecteur de clonage. En outre, chaque molécule vectorielle doit être coupée exactement à la même position sur le cercle – comme cela apparaîtra dans les chapitres suivants Le clivage, aléatoire n’est pas satisfaisant. Il doit être clair qu’un type très spécial de nucléase est nécessaire pour effectuer cette manipulation. Souvent, il est également nécessaire de cliver l’ADN qui doit être cloné. Il y a deux raisons à cela.

Premièrement, si l’objectif est de cloner un seul gène, qui peut se composer seulement de 2 ou 3 kb d’ADN, alors ce gène devra être coupé des grosses molécules d’ADN (souvent plus de 80 kb) produites par l’utilisation habile des techniques de préparation décrites au chapitre 3.

Deuxièmement, de grandes molécules d’ADN peuvent avoir à être décomposées simplement pour produire des fragments suffisamment petits pour être portés par le vecteur. La plupart des vecteurs de clonage présentent une préférence pour des fragments d’ADN qui tombent dans une plage de tailles particulière: la plupart des vecteurs à base de plasmide, par exemple, sont très inefficaces au clonage de molécules d’ADN de plus de 8 kb de longueur.
Les endonucléases de restriction purifiées permettent au biologiste moléculaire de découper des molécules d’ADN de manière précise et reproductible pour le clonage de gènes. La découverte de ces enzymes, qui a conduit à des prix Nobel pour W. Arber, H. Smith et D. Nathans en 1978, a été l’une des percées clés dans le développement du génie génétique.

La découverte et la fonction des endonucléases de restriction :

L’observation initiale qui a mené à la découverte d’endonucléases de restriction a été faite au début des années 1950, quand il a été montré que certaines souches de bactéries sont immunisées contre l’infection par bactériophage, un phénomène appelé la restriction contrôlée par l’hôte. Le mécanisme de restriction n’est pas très compliqué, même s’il a fallu plus de 20 ans pour être pleinement compris. La restriction se produit parce que la bactérie produit une enzyme qui dégrade l’ADN du phage avant qu’il ait le temps de se répliquer et de diriger la synthèse de nouvelles particules de phage. Le propre ADN de la bactérie, dont la destruction serait évidemment mortelle, est protégé contre l’attaque car il transporte des groupes méthyle supplémentaires qui bloquent l’action enzymatique dégradante. Ces enzymes dégradantes sont appelées endonucléases de restriction et sont synthétisées par de nombreuses espèces bactériennes, peut-être toutes: plus de 2500 différentes ont été isolées et plus de 300 sont disponibles pour être utilisées au laboratoire.

Trois classes différentes d’endonucléases de restriction sont reconnues, chacune étant distinguée par un mode d’action légèrement différent. Les types I et III sont plutôt complexes et n’ont qu’un rôle limité dans le génie génétique. Par contre les endonucléases de restriction de type II, sont très importantes dans le clonage de gènes.

Les endonucléases de restriction de type II coupent l’ADN à des séquences nucléotidiques spécifiques :

La caractéristique centrale des endonucléases de restriction de type II (que l’on appellera simplement « endonucléases de restriction ») est que chaque enzyme a une séquence de reconnaissance spécifique au niveau de laquelle elle coupe une molécule d’ADN. Une enzyme particulière qui clive l’ADN à la séquence de reconnaissance spécifique n’a aucun effet ailleurs. Par exemple, l’endonucléase de restriction appelée PvuI (isolée de Proteus vulgaris) coupe l’ADN uniquement au niveau de l’hexanucléotide CGATCG. Par contre, une seconde enzyme de la même bactérie, appelée PvuII, coupe au niveau de l’hexanucléotide CAGCTG. De nombreuses endonucléases de restriction reconnaissent les sites cibles hexanucléotidiques, mais d’autres coupent à quatre, cinq, huit ou même des séquences nucléotidiques plus longues. Sau3A (de Staphylococcus aureus souche 3A) reconnaît GATC, et AluI (Arthrobacter luteus) coupe à AGCT. Il existe également des exemples d’endonucléases de restriction avec des séquences de reconnaissance dégénérées, ce qui signifie qu’elles coupent l’ADN à n’importe quel d’une famille de sites apparentés. HinfI (Haemophilus Influenzae souche Rf), par exemple, reconnaît GANTC, donc coupe à GAATC, GATTC, GAGTC et GACTC. Les séquences de reconnaissance pour certaines des endonucléases de restriction les plus fréquemment utilisées sont énumérées dans le tableau ci-dessous.

Extrémités coupantes et extrémités collantes:

La nature exacte de la coupe produite par une endonucléase de restriction est d’une importance considérable dans la conception d’une expérience de clonage de gène. De nombreuses endonucléases de restriction font une simple coupure double brin au milieu de la séquence de reconnaissance, ce qui a pour résultat une extrémité franche ou une extrémité affleurante. PvuII et AluI sont des exemples qui donnent une coupure à extrémités franches.

D’autres endonucléases de restriction coupent l’ADN d’une manière légèrement différente. Avec ces enzymes, les deux brins d’ADN ne sont pas coupés exactement dans la même position. Au lieu de cela, le clivage est échelonné, habituellement par deux ou quatre nucléotides, de sorte que les fragments d’ADN résultants présentent des surplombs simples à chaque extrémité. Ceux-ci sont appelés des extrémités collantes ou cohésives, car l’appariement de base entre elles peut coller la molécule d’ADN ensemble encore.

Une caractéristique importante des enzymes terminales collantes est que les endonucléases de restriction avec différentes séquences de reconnaissance peuvent produire les mêmes extrémités collantes. BamHI (séquence de reconnaissance GGATCC) et BglII (AGATCT) sont des exemples – les deux produisent des extrémités collantes GATC. La même extrémité collante est également produite par Sau3A, qui ne reconnaît que le tétranucléotide GATC. Des fragments d’ADN produits par clivage avec l’une ou l’autre de ces enzymes peuvent être joints l’un à l’autre, chaque fragment portant une extrémité collante complémentaire.

La fréquence des séquences de reconnaissance dans une molécule d’ADN :

Le nombre de séquences de reconnaissance pour une endonucléase de restriction particulière dans une molécule d’ADN de longueur connue peut être calculée mathématiquement. Une séquence tétranucléotidique (Par exemple, GATC) doit se produire une fois tous les 44 = 256 nucléotides, et un hexanucléotide (Par exemple, GGATCC) une fois tous les 46 = 4096 nucléotides. Ces calculs supposent que les nucléotides sont ordonnés d’une manière aléatoire et que les quatre nucléotides différents sont présent dans des proportions égales (c’est-à-dire, la teneur en GC = 50%).

En pratique, aucun de ces hypothèses n’est entièrement valable. Par exemple, la molécule d’ADN e, à 49 kb, devrait contenir environ 12 sites pour une endonucléase de restriction avec une séquence de reconnaissance hexanucléotidique . En fait, bon nombre de ces sites de reconnaissance se produisent moins fréquemment (par exemple, six Pour BglII, cinq pour BamHI, et seulement deux pour SalI). En outre, les sites de restriction ne sont pas espacés uniformément le long d’une molécule d’ADN. Si elles l’étaient, alors la digestion avec une endonucléase de restriction particulière donnerait des fragments de tailles approximativement égales. Quand on étudie les fragments produits par BglII, BamHI et SalI, dans chaque cas, il existe des fragments, de taille différente indiquant que les nucléotides (de l’ADN ) ne sont pas ordonnés aléatoirement. La leçon à tirer est que, bien que les mathématiques pourraient donner une idée du nombre de sites de restriction dans une molécule d’ADN, l’ analyse peut fournir la vraie image.

Des efforts considérables ont été déployés pour développer  des systèmes de vecteurs pour le clonage des cellules animales. Ces vecteurs sont nécessaires en biotechnologie pour la synthèse de protéines recombinantes à partir de gènes qui ne sont pas exprimés correctement lorsqu’ils sont clones dans E. coli ou la levure. Les méthodes de clonage chez l’homme sont recherchées par des biologistes moléculaires cliniques essayant de concevoir des techniques pour La thérapie génique  dans laquelle une maladie est traitée par introduction d’un gène cloné chez le patient. la majeure partie de l’attention a été portée sur les systèmes de clonage pour les mammifères, mais des progrès importants ont également été réalisés avec les insectes. Le clonage chez les insectes est intéressant car il fait appel à un nouveau type de vecteur que nous n’avons pas encore rencontré.

Les vecteurs de clonages pour insectes :

La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été et est encore l’un des organismes modèles les plus importants utilisés par les biologistes. Son potentiel a d’abord été reconnu par le généticien célèbre Thomas Hunt Morgan, qui, en 1910 a commencé à effectuer des croisements génétiques entre les mouches des fruits avec différentes couleurs des yeux, des formes du corps, et d’autres caractéristiques héritées. Ces expériences ont conduit aux techniques encore utilisées aujourd’hui pour la cartographie des gènes chez les insectes et d’autres animaux. Plus récemment, la découverte que les gènes sélecteurs homéotiques de Drosophila, les gènes qui contrôlent le plan global du corps de la mouche des fruits sont étroitement liés à des gènes équivalents chez les mammifères, a conduit à ce que le D. melanogaster soit utilisé comme modèle pour l’étude du développement de l’homme. L’importance de la mouche des fruits dans la biologie moderne est liée au fait que les vecteurs de clonage dans cet organisme sont disponibles.Le développement des vecteurs de clonage pour la Drosophile a pris une voie différente de celle suivie pour les bactéries, les levures, les plantes et les mammifères. Aucun plasmide n’est connu dans la Drosophile et bien que les mouches des fruits, comme tous les organismes, soient sensibles à l’infection par les virus, ils n’ont pas été utilisés comme base pour les vecteurs de clonage. Au lieu de cela, le clonage de la Drosophile utilise un transposon appelé l’élément P. Les transposons sont communs à tous les types d’organismes. Ce sont des fragments courts d’ADN (généralement moins de 10 kb de longueur) qui peuvent se déplacer d’une position à l’autre dans les chromosomes d’une cellule.

 

Les éléments P comme vecteurs de clonage de Drosophila :

Le développement des vecteurs de clonage pour la Drosophile a pris une voie différente de celle suivie pour les bactéries, les levures, les plantes et les mammifères. Aucun plasmide n’est connu dans la Drosophile et bien que les mouches des fruits, comme tous les organismes, soient sensibles à l’infection par les virus, ils n’ont pas été utilisés comme base pour les vecteurs de clonage. Au lieu de cela, le clonage de la Drosophile utilise un transposon appelé l’élément P. Les transposons sont communs à tous les types d’organismes. Ce sont des fragments courts d’ADN (généralement moins de 10 kb de longueur) qui peuvent se déplacer d’une position à l’autre dans les chromosomes d’une cellule.Les éléments P, qui sont l’un des plusieurs types de transposons dans la Drosophile, ont une longueur de 2,9 kb et contiennent trois gènes flanqués de séquences répétées inversées courtes à chaque extrémité de l’élément. Les gènes codent pour la transposase, l’enzyme qui effectue le processus de transposition et les répétitions inversées forment les séquences de reconnaissance qui permettent à l’enzyme d’identifier les deux extrémités du transposon inséré.

Les éléments P, qui sont l’un des plusieurs types de transposons dans la Drosophile, ont une longueur de 2,9 kb et contiennent trois gènes flanqués de séquences répétées inversées courtes à chaque extrémité de l’élément. Les gènes codent pour la transposase, l’enzyme qui effectue le processus de transposition et les répétitions inversées forment les séquences de reconnaissance qui permettent à l’enzyme d’identifier les deux extrémités du transposon inséré.

En plus de se déplacer d’une position  à une autre au sein d’un même chromosome, les éléments P peuvent également sauter entre les chromosomes ou entre un plasmide portant un élément P et un des chromosomes de la mouche. Ce dernier est la clé de l’utilisation des éléments P comme vecteurs de clonage. Le vecteur est un plasmide qui porte deux éléments P, dont l’un contient le site d’insertion de l’ADN qui sera cloné. L’insertion du nouvel ADN dans cet élément P entraîne une perturbation de son gène transposase, de sorte que cet élément est inactif. Le second élément P porté par le plasmide est donc celui qui a une version intacte du gène de transposase. Idéalement, ce second élément ne devrait pas être transféré aux chromosomes de Drosophila, il a donc ses «ailes clippées»: ses répétitions inversées sont supprimées afin que la transposase ne le reconnaisse pas comme un élément P réel.

Une fois que le gène à cloner a été inséré dans le vecteur, l’ADN plasmidique est micro-injecté dans des embryons de mouches de fruit. La transposase de l’élément P qui est découpé de ses ailes, dirige le transfert de l’élément P transformé dans l’un des chromosomes de la mouche des fruits. Si cela se produit dans un noyau germinal, alors la mouche adulte qui se développe à partir de l’embryon portera des copies du gène cloné dans toutes ses cellules. Le clonage des éléments P a été développé dans les années 1980 et a apporté un certain nombre de contributions importantes à la génétique de la drosophile.

Bien que les vecteurs de virus n’aient pas été développés pour le clonage de gènes chez la drosophile, un type de virus, le baculovirus, a joué un rôle important dans le clonage de gènes avec d’autres insectes. L’utilisation principale de vecteurs de baculovirus est dans la production de protéine recombinante.

Les vecteurs de clonage à base de virus d’insectes:

Bien que les vecteurs de virus n’aient pas été développés pour le clonage de gènes chez la drosophile, un type de virus, le baculovirus, a joué un rôle important dans le clonage de gènes avec d’autres insectes. L’utilisation principale de vecteurs de baculovirus est dans la production de protéine recombinante.

 Clonage chez les mammifères :

à l’heure actuelle, le clonage de gènes chez les mammifères est réalisé pour l’une des trois raisons suivantes:

1) pour obtenir un knock-out de gène, qui est une technique importante utilisée pour aider à déterminer la fonction d’un gène non identifié. Ces expériences sont généralement réalisées avec des rongeurs tels que des souris.

2) Pour la production de protéine recombinante dans une culture de cellules de mammifère, et dans la technique apparentée de pharming, qui implique le génie génétique d’un animal de ferme de sorte qu’il synthétise une protéine importante telle qu’un produit pharmaceutique, souvent Dans son lait .

3) En thérapie génique, dans laquelle des cellules humaines sont manipulées pour traiter une maladie.

Les virus comme vecteurs de clonage pour les mammifères :

Pendant de nombreuses années, on pensait que les virus allaient jouer un rôle clé dans le clonage des mammifères. Cette attente n’est que partiellement réalisée. La première expérience de clonage impliquant des cellules de mammifères a été réalisée en 1979 avec un vecteur à base de virus simien 40 (SV40).

Ce virus est capable d’infecter plusieurs espèces de mammifères, suivant un cycle lytique chez certains hôtes et un cycle lysogène chez d’autres. Le génome a une taille de 5,2 kb et contient deux ensembles de gènes, les gènes « précoces », exprimés au début du cycle d’infection et codant pour les protéines impliquées dans la réplication de l’ADN viral, et les gènes « tardifs » codant pour Protéines de capside virale. SV40 souffre du même problème que les caulimovirus des plantes, dans la mesure où les contraintes d’emballage limitent la quantité d’ADN nouveau qui peut être inséré dans le génome. Le clonage avec SV40 implique donc le remplacement d’un ou plusieurs des gènes existants par l’ADN à cloner. Dans l’expérience initiale, un segment de la région du gène tardif a été remplacé, mais le remplacement du gène précoce est également une option. Depuis 1979, un certain nombre d’autres types de virus ont été utilisés pour cloner des gènes chez des mammifères :
A) Les adénovirus, qui permettent de cloner des fragments d’ADN allant jusqu’à 8 kb, donc an ADN plus long que ce qui est possible avec un vecteur SV40, bien que les adénovirus soient plus difficiles à manipuler car leurs génomes sont plus grands.

B) Les papillomavirus, qui ont également une capacité relativement élevée pour l’ADN inséré. Le papillomavirus bovin (BPV), qui provoque des verrues sur le bétail, est particulièrement attrayant car il a un cycle d’infection inhabituel dans les cellules de souris, prenant la forme d’un plasmide multi-copie avec environ 100 molécules présentes par cellule. Il ne provoque pas la mort de la cellule de souris, et les molécules de BPV sont transmises à des cellules filles par division cellulaire, donnant lieu à une lignée cellulaire transformée en permanence. Des vecteurs navettes constitués de séquences BPV et E. coli, et capables de réplication dans des cellules de souris et bactériennes, ont été utilisés pour la production de protéines recombinantes dans des lignées cellulaires de souris.

C) Le virus adéno-associé (AAV), qui n’est pas lié à l’adénovirus mais qui se retrouve souvent dans les mêmes tissus infectés, car AAV utilise certaines des protéines synthétisées par les adénovirus pour achever son cycle de réplication. En l’absence de ce virus auxiliaire, le génome AAV s’insère dans l’ADN de son hôte. Come dans la plupart des virus intégratifs, il s’agit d’un événement aléatoire, mais l’AAV a la propriété inhabituelle de toujours s’insérer à la même position, au sein du chromosome humain 19. Il est important de savoir exactement où le gène cloné sera dans le génome hôte si le résultat de l’expérience de clonage doit être rigoureusement contrôlé, comme c’est le cas dans des applications telles que la thérapie génique. Les vecteurs AAV sont donc considérés comme ayant un potentiel majeur dans ce domaine.

D) Les rétrovirus, qui sont les vecteurs les plus couramment utilisés pour la thérapie génique. Bien qu’ils s’insèrent dans des positions aléatoires, les résultants sont très stables, ce qui signifie que les effets thérapeutiques du gène cloné persisteront pendant un certain temps. Nous reviendrons à la thérapie génique plus tard.L’une des raisons pour lesquelles les vecteurs de virus n’ont pas été généralisés dans le clonage de gènes de mammifères est parce qu’il a été découvert au début des années 1990 que la manière la plus efficace de transférer de nouveaux gènes dans des cellules de mammifères est par micro-injection. Bien qu’une procédure difficile à mettre en oeuvre, la micro-injection de plasmides bactériens, ou des copies d’ADN linéaires de gènes, dans des noyaux de mammifères conduit à l’insertion de l’ADN dans les chromosomes, éventuellement en multiples copies dans un agencement tandem tête-à-queue. ). Cette procédure est généralement considérée comme plus satisfaisante que l’utilisation d’un vecteur viral car elle évite la possibilité que l’ADN viral  infecte les cellules et provoque des défauts quelconques. La micro-injection d’ADN est la base de la création d’un animal transgénique, qui contient un gène cloné dans toutes ses cellules. Une souris transgénique peut être générée par micro-injection d’un ovule fécondé qui est ensuite cultivé in vitro pour plusieurs divisions cellulaires et ensuite implanté dans une mère nourricière. En outre, une cellule embryonnaire  peut aussi être utilisée. Celles-ci sont obtenus à partir d’un embryon précoce et, contrairement à la plupart des cellules de mammifères, sont totipotents, ce qui signifie que leur modèle de développement n’est pas prédéfini et les cellules descendantes peuvent former de nombreuses structures différentes chez la souris adulte. Après micro-injection, la cellule embryonnaire est replacée dans un embryon qui est implanté dans l’utérus de la mère. La souris résultante est une chimère, comprenant un mélange de cellules modifiées et non modifiées, car l’embryon qui reçoit la cellule manipulée contient également un certain nombre de cellules ordinaires qui contribuent, avec la cellule manipulée, à la composition de la Souris adulte. On obtient des souris non-chimères, qui contiennent le gène cloné dans toutes leurs cellules, en permettant à la chimère de se reproduire, car une partie de la progéniture sera dérivée d’ovules qui contiennent le gène cloné.

Clonage de gènes sans vecteur :

L’une des raisons pour lesquelles les vecteurs de virus n’ont pas été généralisés dans le clonage de gènes de mammifères est parce qu’il a été découvert au début des années 1990 que la manière la plus efficace de transférer de nouveaux gènes dans des cellules de mammifères est par micro-injection. Bien qu’une procédure difficile à mettre en oeuvre, la micro-injection de plasmides bactériens, ou des copies d’ADN linéaires de gènes, dans des noyaux de mammifères conduit à l’insertion de l’ADN dans les chromosomes, éventuellement en multiples copies dans un agencement tandem tête-à-queue. ). Cette procédure est généralement considérée comme plus satisfaisante que l’utilisation d’un vecteur viral car elle évite la possibilité que l’ADN viral  infecte les cellules et provoque des défauts quelconques. La micro-injection d’ADN est la base de la création d’un animal transgénique, qui contient un gène cloné dans toutes ses cellules. Une souris transgénique peut être générée par micro-injection d’un ovule fécondé qui est ensuite cultivé in vitro pour plusieurs divisions cellulaires et ensuite implanté dans une mère nourricière. En outre, une cellule embryonnaire  peut aussi être utilisée. Celles-ci sont obtenus à partir d’un embryon précoce et, contrairement à la plupart des cellules de mammifères, sont totipotents, ce qui signifie que leur modèle de développement n’est pas prédéfini et les cellules descendantes peuvent former de nombreuses structures différentes chez la souris adulte. Après micro-injection, la cellule embryonnaire est replacée dans un embryon qui est implanté dans l’utérus de la mère. La souris résultante est une chimère, comprenant un mélange de cellules modifiées et non modifiées, car l’embryon qui reçoit la cellule manipulée contient également un certain nombre de cellules ordinaires qui contribuent, avec la cellule manipulée, à la composition de la Souris adulte. On obtient des souris non-chimères, qui contiennent le gène cloné dans toutes leurs cellules, en permettant à la chimère de se reproduire, car une partie de la progéniture sera dérivée d’ovules qui contiennent le gène cloné.

Les principes fondamentaux de la préparation de l’ADN sont plus faciles à comprendre en examinant d’abord le type le plus simple de procédure de purification d’ADN, celui où le complément d’ADN entier d’une cellule bactérienne est nécessaire. Les modifications nécessaires pour la préparation d’ADN de plasmide et de phage peuvent ensuite être décrites ultérieurement. La procédure pour la préparation d’ADN totale à partir d’une culture de cellules bactériennes peut être divisée en quatre étapes :

1 Une culture de bactéries est lancée,  puis récoltée.
2 Les cellules sont brisées pour libérer leur contenu.
3 Cet extrait cellulaire est traité pour enlever tous les composants sauf l’ADN.
4 La solution d’ADN résultante est concentrée.

Cultiver et récolter une culture bactérienne :

La plupart des bactéries peuvent être cultivées sans trop de difficulté dans un milieu liquide (culture de bouillon). Le milieu de culture doit fournir un mélange équilibré des nutriments essentiels à des concentrations qui permettront aux bactéries de croître et de se diviser efficacement. Deux milieux de croissance typiques sont détaillés dans le tableau ci dessous. M9 est un exemple d’un milieu défini dans lequel tous les composants sont connus. Ce milieu contient un mélange de nutriments inorganiques pour fournir des éléments essentiels tels que l’azote, le magnésium et le calcium, ainsi que le glucose pour fournir du carbone et de l’énergie. En pratique, d’autres facteurs de croissance tels que les oligo-éléments et les vitamines doivent être ajoutés à M9 avant qu’il ne favorise la croissance bactérienne. Précisément quels suppléments sont nécessaires dépend des espèces concernées. Le second milieu décrit dans ce tableau est assez différent. Luria-Bertani (LB) est un milieu complexe ou indéfini, ce qui signifie que l’identité précise et la quantité de ses composantes ne sont pas connues. C’est parce que deux des ingrédients, tryptone et extrait de levure, sont des mélanges compliqués de composés chimiques inconnus. Tryptone fournit en effet des acides aminés et de petits peptides, alors que l’extrait de levure (une préparation séchée de cellules de levure partiellement digérées) fournit les besoins en azote, ainsi que des sucres et des nutriments inorganiques et organiques. Les milieux complexes tels que LB n’ont besoin d’aucune autre supplémentation et favorisent la croissance d’une large gamme d’espèces bactériennes. Les milieux définis doivent être utilisés lorsque la culture bactérienne doit être cultivée dans des conditions précisément contrôlées. Cependant, cela n’est pas nécessaire lorsque la culture est cultivée simplement comme une source d’ADN, et dans ces circonstances un milieu complexe est approprié. Dans un milieu LB à 37 ° C, aéré par secousses à 150-250 tr / min sur une plate-forme rotative, les cellules d’E. Coli se divisent une fois toutes les 20 minutes environ jusqu’à ce que la culture atteigne une densité maximale d’environ 2-3 x 109 cellules / ml.

La croissance de la culture peut être contrôlée en lisant la densité optique (OD) à 600 nm , dans ces conditions  1 unité OD correspond à environ 0,8 x 109 cellules / ml.

Pour préparer un extrait cellulaire, les bactéries doivent être obtenues dans un volume aussi petit que possible. La récolte est donc effectuée en faisant tourner la culture dans une centrifugeuse. Des vitesses de centrifugation assez faibles vont précipiter les bactéries au fond du tube de centrifugation, ce qui permet d’éliminer le liquide du milieu de culture. Ainsi les bactéries d’une culture de 1000 ml à densité cellulaire maximale peuvent alors être remises en suspension dans un volume de 10 ml ou moins.

Préparation d’un extrait cellulaire:

La cellule bactérienne est enfermée dans une membrane cytoplasmique et entourée d’une parois cellulaire rigide. Avec certaines espèces, dont E. coli, la paroi cellulaire peut elle-même être enveloppée par un deuxième parois, la membrane externe. Toutes ces barrières doivent être brisées pour libérer les composants cellulaires. Les techniques de rupture des cellules bactériennes peuvent être divisées en méthodes physiques, dans lesquels les cellules sont perturbées par des forces mécaniques, et des procédés chimiques, où la lyse cellulaire est provoquée par l’exposition à des agents chimiques qui affectent l’intégrité de la barrière cellulaire. Les méthodes chimiques sont les plus couramment utilisées avec les cellules bactériennes lorsque le but est la préparation d’ADN. La lyse chimique implique généralement un agent attaquant la paroi cellulaire et un autre Perturbant la membrane cellulaire (figure 3.4a). Les produits chimiques utilisés dépendent des bactéries concernées mais avec E. coli et les organismes apparentés, l’affaiblissement de la paroi cellulaire est habituellement provoquée par le lysozyme, le tétraacétate d’éthylènediamine (EDTA), Ou une combinaison des deux. Le lysozyme est une enzyme présente dans le blanc d’œuf et Sécrétions telles que les larmes et la salive, et qui digère les composés polymères donnent à la paroi cellulaire sa rigidité. L’EDTA élimine les ions magnésium qui sont essentiels à la conservation de la structure globale de l’enveloppe cellulaire, et inhibe également les enzymes cellulaires qui pourrait dégrader l’ADN. Dans certaines conditions, l’affaiblissement de la paroi cellulaire avec le lysozyme ou L’EDTA est suffisant pour provoquer l’éclatement des cellules bactériennes, mais habituellement un détergent tel que le sodium dodécylsulfate(SDS) est également ajouté. Les détergents aident le processus de lyse en éliminant les ipides de la membrane et en provoquent ainsi une destruction des membranes cellulaires. Après avoir lysé les cellules, l’étape finale dans la préparation d’un extrait cellulaire est l’élimination de Débris cellulaires insolubles. Des composants tels que des fractions de parois cellulaires partiellement digérées peuvent être séparées par centrifugation, laissant l’extrait de cellule comme étant un sur surnageant raisonnablement limpide.

Purification of DNA from a cell extract :

En plus de l’ADN, un extrait cellulaire bactérien contient des quantités significatives de protéine et d’ARN. Divers procédés peuvent être utilisés pour purifier l’ADN de ce mélange. Une approche consiste à traiter le mélange avec des réactifs qui dégradent les contaminants, laissant une solution pure d’ADN (figure 3.5a). D’autres procédés utilisent la chromatographie par échange d’ions pour séparer le mélange en ses différents composants, de sorte que l’ADN est séparé des protéines et de l’ARN dans l’extrait (figure 3.5b). L’élimination des contaminants par extraction organique et digestion enzymatique est une procédée connue de déprotéinisation d’ un extrait cellulaire et  consiste à ajouter du phénol ou un mélange 1: 1 de phénol et de chloroforme à la solution. Ces solvants organiques précipitent des protéines mais laissent les acides nucléiques (ADN et ARN) en solution aqueuse. Le résultat est que si l’extrait cellulaire est mélangé doucement avec le solvant et centrifugé , les molécules de protéines précipitées seront sous la forme d’une masse coagulée blanche à l’interface entre les couches aqueuse et organique (figure 3.6).

La solution aqueuse d’acides nucléiques peut alors être séparée avec une pipette. Avec certains extraits cellulaires, la teneur en protéines est tellement grande qu’une extraction phénolique unique n’est pas suffisante pour purifier complètement les acides nucléiques. Ce problème pourrait être résolu en effectuant plusieurs extractions de phénol les unes après les autres, mais cela n’est pas souhaitable car chaque étape de mélange et de centrifugation entraîne une certaine quantité de rupture des molécules d’ADN. La réponse est de traiter l’extrait cellulaire avec une protéase telle que la pronase ou protéinase K avant l’extraction du phénol. Ces enzymes brisent les polypeptides des unités plus petites, qui sont plus faciles à éliminer par le phénol. Certaines molécules d’ARN, en particulier l’ARN messager (ARNm), sont éliminées par le phénol mais la plupart restent avec l’ADN dans la couche aqueuse. Le seul moyen efficace pour éliminer l’ARN est avec l’enzyme ribonucléase, ce qui dégrade rapidement ces molécules dans les sous-unités ribonucléotidiques.

Utilisation de la Chromatographie par échange d’ions pour purifier l’ADN d’un extrait cellulaire:

Les biochimistes ont mis au point divers procédés pour utiliser des différences de charge électrique des  mélanges pour séparer des produits chimiques à leurs composants individuels. Une de ces méthodes est la chromatographie par échange d’ions, qui sépare les molécules selon leur l’intensité de liaison électrique à des particules chargées présentes dans une matrice chromatographique ourésine. L’ADN et l’ARN sont tous les deux chargés négativement, tout comme certaines protéines, et se lient ainsi à une résine chargée positivement. La fixation électrique est interrompue par le sel, ainsi l’élimination des molécules plus étroitement liées nécessitant des concentrations plus élevées de sel. En augmentant progressivement la concentration en sel, différents types de molécules peuvent être détachés de la résine l’un après l’autre. La manière la plus simple d’effectuer une chromatographie par échange d’ions est de placer la résine dans une colonne de verre ou de plastique, puis ajouter l’extrait de cellule au sommet . L’ extrait passe à travers la colonne, et parce que cet extrait contient très peu de sel toutes les molécules chargées négativement se lient à la résine et sont retenues dans la colonne. Si une solution saline de concentration progressivement croissante est maintenant passée à travers la colonne, les différents types de molécules vont se détacher de la résine dans l’ordre : la protéine, ARN, et enfin l’ADN. Toutefois, une telle séparation minutieuse n’est généralement pas nécessaire et deux solutions salines, dont la concentration est suffisante pour séparer  la protéine et ARN, laissant seulement l’ADN lié, suivi d’une seconde d’une concentration plus élevée Qui élue l’ADN, maintenant exempt de protéines et d’ARN contaminants.

La concentration d’échantillons d’ADN :

L’extraction organique aboutit souvent à une solution d’ADN très concentrée qui n’a plus besoin d’être concentrée. D’autres procédés de purification donnent des solutions plus diluées et il est donc important de considérer des procédés pour augmenter la concentration d’ADN. La méthode de concentration la plus fréquemment utilisée est la précipitation à l’éthanol. En présence de sel (à proprement parler, des cations monovalents tels que les ions sodium (Na +)), et à une température de -20 ° C ou moins, l’éthanol absolu précipite efficacement des acides nucléiques polymères. Avec une solution d’ADN concentrée, l’éthanol peut flotter sur le dessus de l’échantillon, ce qui provoque la précipitation des molécules à l’interface. Un truc spectaculaire est de pousser une tige de verre à travers l’éthanol dans la solution d’ADN. Lorsque la tige est retirée, les molécules d’ADN adhèrent et peuvent être retirées de la solution sous la forme d’une longue fibre (figure 3.8a). En variante, si l’éthanol est mélangé avec une solution d’ADN diluée, le précipité peut être recueilli par centrifugation (figure 3.8b), puis redissous dans un volume approprié d’eau. La précipitation à l’éthanol présente l’avantage supplémentaire de laisser des composants d’acides nucléiques à chaîne courte et monomères en solution. Les ribonucléotides produits par le traitement à la ribonucléase sont donc perdus à ce stade.

La mesure de la concentration d’ADN :

Il est crucial de savoir exactement combien d’ADN est présent dans une solution lors de la réalisation d’une expérience de clonage de gène. Heureusement, les concentrations d’ADN peuvent être mesurées avec précision par spectrophotométrie par absorption ultraviolette (UV). La quantité de rayonnement UV absorbée par une solution d’ADN est directement proportionnelle à la quantité d’ADN dans l’échantillon. Habituellement, l’absorbance est mesurée à 260 nm, à cette longueur d’onde (A260) une absorbance de 1,0 correspond à 50 mg d’ADN bicaténaire par ml. Des mesures d’une solution d’ADN aussi peu que 1 fl peuvent être réalisées dans des spectrophotomètres conçus spécialement à cet effet. L’absorbance ultraviolette peut également être utilisée pour vérifier la pureté d’une préparation d’ADN. Avec un échantillon pur d’ADN, le rapport des absorbances à 260 et 280 nm (A260 / A280) est de 1,8. Des rapports inférieurs à 1,8 indiquent que la préparation est contaminée, soit avec des protéines, soit avec du phénol.

D’autres procédés pour la préparation d’ADN cellulaire total

Les bactéries ne sont pas les seuls organismes dont l’ADN peut être nécessaire. ADN cellulaire total par exemple des plantes ou des animaux seront nécessaires si le but du projet de génie génétique est de cloner des gènes de ces organismes. Bien que les étapes fondamentales de la purification de l’ADN sont les mêmes, quel que soit l’organisme, certaines modifications devront être introduites pour tenir compte des particularités des cellules utilisées. Évidemment, la croissance des cellules en milieu liquide ne convient que pour les bactéries, des microorganismes et des cultures de cellules végétales et animales sont plus spécifiques. Des modifications majeures, sont susceptibles d’être nécessaires à l’étape de rupture cellulaire. Les produits chimiques utilisés pour les bactéries ne marchent pas habituellement avec d’autres organismes: le lysozyme, par exemple, n’a aucun effet sur les cellules végétales. Des enzymes de dégradation spécifiques sont disponibles pour la plupart des types de parois cellulaires, mais souvent des techniques physiques, telles que le broyage de matériel congelé avec un mortier et pilon, sont plus efficaces. D’autre part, la plupart des cellules animales n’ont pas de paroi cellulaire du tout, et peuvent être lysées simplement par traitement avec un détergent.

Une autre considération importante est la teneur biochimique des cellules dont L’ADN est extrait. Avec la plupart des bactéries, les principaux produits biochimiques qui sont  présents dans un extrait cellulaire sont la protéine, l’ADN et l’ARN donc l’extraction du phénol et/ou le traitement par la protéase, Suivi par l’élimination de l’ARN avec la ribonucléase, laisse un échantillon d’ADN pur. Ces traitements ne peuvent cependant pas être suffisants pour donner de l’ADN pur si les cellules contiennent également des quantités importantes d’autres produits biochimiques. Les tissus végétaux sont particulièrement difficiles parce qu’ils contiennent souvent de grandes quantités d’hydrates de carbone qui ne sont pas éliminés par l’extraction au phénol. Il faut plutôt adopter une approche différente. Une méthode utilise D’un détergent appelé bromure de cétyltriméthylammonium (BCTA), qui forme un complexe  Insoluble avec des acides nucléiques.

Lorsque le BCTA (bromure de cétyltriméthylammonium) est ajouté à un extrait de cellule végétale, le complexe acide nucléique-BCTA précipite, laissant des glucides, des protéines et d’autres contaminants dans le surnageant. Le précipité est ensuite recueilli par centrifugation et remis en suspension dans du chlorure de sodium 1 M, ce qui provoque la décomposition du complexe. Les acides nucléiques peuvent maintenant être concentrés par précipitation à l’éthanol et L’ARN éliminé par traitement par ribonucléase. La nécessité d’adapter les méthodes d’extraction organique pour tenir compte des contenus biochimiques de différents types de produits de départ a stimulé la recherche de méthodes de purification d’ADN utilisables avec n’importe quelle espèce. C’est une des raisons pour lesquelles la chromatographie par échange d’ions est devenue si populaire. Une méthode similaire implique un composé appelé thiocyanate de guanidinium, qui a deux propriétés qui le rendent utile pour la purification de l’ADN. Tout d’abord, il dénature et dissout tous les produits biochimiques autres que les acides nucléiques et peut donc être utilisé pour libérer de l’ADN de pratiquement n’importe quel type de cellule ou de tissu. Deuxièmement, en présence de thiocyanate de guanidinium, l’ADN se lie étroitement aux particules de silice (figure 3.10a). Ceci fournit un moyen facile de récupérer l’ADN du mélange dénaturé de produits biochimiques. Une possibilité est d’ajouter la silice directement à l’extrait de cellule mais, comme avec les procédés d’échange d’ions, il est plus commode d’utiliser une colonne de Chromatographie. La silice est placée dans la colonne et l’extrait de cellule ajouté (figure 3.10b). L’ADN se lie à la silice et est retenu dans la colonne, tandis que les produits biochimiques dénaturés passent tout droit. Après lavage des derniers contaminants avec une solution de thiocyanate de guanidinium, l’ADN est récupéré en ajoutant de l’eau, ce qui déstabilise les interactions entre les molécules d’ADN et la silice.

La PCR est une technique très simple: tout ce qui se passe est qu’une petite région d’une molécule d’ADN, par exemple un seul gène, est copiée à plusieurs reprises par une enzyme ADN polymérase. Cela peut sembler un exercice plutôt trivial, mais il a une multitude d’applications dans la recherche génétique et dans des domaines plus larges de la biologie. Nous commencerons ce chapitre par un aperçu de la réaction en chaîne de la polymérase pour comprendre exactement ce qu’il réalise. Ensuite, nous examinerons les questions clés qui déterminent si une expérience de PCR individuelle est réussie, avant d’examiner quelques-unes des méthodes qui ont été conçues pour étudier les fragments d’ADN amplifiés qui sont obtenus.

La PCR (polymerase chaine reaction ) en détaille :

La réaction en chaîne par polymerase conduit à l’amplification sélective d’une région choisie d’une molécule d’ADN. Toute région de n’importe quelle molécule d’ADN peut être choisie, pour autant que les séquences aux frontières de la région soient connues. Les séquences de la frontière doivent être connues car, pour effectuer une PCR, deux oligonucleotides courts doivent s’hybrider à la molécule d’ADN, un à chaque brin de la double hélice . Ces oligonucleotides, qui servent d’amorces pour les réactions de synthèse d’ADN, délimitent la région qui sera amplifié. L’amplification est habituellement effectuée par l’enzyme ADN polymérase I de Thermus Aquatique. Cet organisme vit dans les sources chaudes, et bon nombre de ses enzymes, y compris la Taq polymerase, sont thermostables, ce qui signifie qu’ils sont résistants à la dénaturation par traitement thermique. Comme on le verra dans un instant, la thermostabilité de la polymérase Taq est une exigence essentielle dans la méthodologie PCR.

Pour réaliser une expérience de PCR, l’ADN cible est mélangé à la polymerase Taq, aux deux amorces oligonucléotidiques et à une réserve de nucleotides. La quantité d’ADN cible peut être très faible, car la PCR est extrêmement sensible et est capable de fonctionner avec une seule molécule de départ. On commence la réaction en chauffant le mélange à 94 ° C. A cette température, les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux polynucleotides de la double hélice sont rompues, de sorte que l’ADN cible devient dénaturé en molécules monocaténaires. La température est ensuite réduite à 50-60 ° C, ce qui se traduit par une certaine réintégration des brins simples de l’ADN cible, mais permet également aux amorces de se fixer à leurs positions de recuit. La synthèse d’ADN peut maintenant commencer, de sorte que la température est élevée à 74 ° C, juste en dessous de l’optimum pour la polymerase Taq. Dans cette première étape de la PCR, un ensemble de « produits longs » est synthétisé à partir de chaque brin de l’ADN cible. Ces polynucleotides ont des extrémités 5 ‘identiques mais des extrémités 3’ aléatoires, ces dernières représentant des positions où la synthèse d’ADN se termine par hasard. Le cycle de dénaturation-recuit-synthèse est maintenant répété. Les produits longs dénaturés et les quatre brins résultants sont copiés au cours de la phase de synthèse d’ADN. Cela donne quatre molécules à double brin, dont deux sont identiques aux produits  du premier cycle et dont deux sont entièrement faits d’ADN nouveau. Au cours du troisième cycle, ces derniers donnent lieu à des «produits courts» dont les extrémités 5 ‘et 3’ sont toutes deux fixées par les positions de recuit d’amorce. Dans les cycles suivants, le nombre de produits courts s’accumule de manière exponentielle (doublant à chaque cycle) jusqu’à ce que l’une des composantes de la réaction s’épuise. Cela signifie qu’après 30 cycles, il y aura plus de 130 millions de produits courts dérivés de chaque molécule de départ. En termes réels, cela équivaut à plusieurs microgrammes de produit de PCR à partir de quelques nanogrammes ou moins d’ADN cible.

A la fin d’une PCR, un échantillon du mélange réactionnel est habituellement analysé par l’électrophorèse sur gel de l’agarose , on verra qu’on a produit suffisamment d’ADN pour le fragment amplifié pour il  soit visible sous la forme d’une bande discrète après coloration au bromure d’éthidium. Cela peut en soi fournir des informations utiles sur la région de l’ADN qui a été amplifiée ou, le produit de PCR peut être examiné par des techniques telles que le séquençage d’ADN.

Concevoir les amorces oligonucléotidiques pour une PCR: 

Les amorces sont la clé du succès ou de l’échec d’une expérience PCR. Si les amorces sont conçues correctement, l’expérience conduit à l’amplification d’un seul fragment d’ADN, correspondant à la région cible de la molécule modèle. Si les amorces sont mal conçues, l’expérience échouera, peut-être parce qu’aucune amplification ne se produit, ou peut-être parce que le mauvais fragment ou plus d’un fragment est amplifié. De toute évidence, beaucoup de réflexion doit être placée dans la conception des amorces. L’élaboration de séquences appropriées pour les amorces n’est pas un problème: elles doivent correspondre aux séquences flanquant la région cible sur la molécule modèle.

 

Chaque amorce doit naturellement être complémentaire (non identique) à son brin matrice pour que l’hybridation se produise, et les extrémités 3 ‘des amorces hybridées doivent pointer l’une vers l’autre. Le fragment d’ADN à amplifier ne doit pas être supérieur à environ 3 kb de longueur et idéalement moins de 1 kb. Des fragments allant jusqu’à 10 kb peuvent être amplifiés par des techniques de PCR standard, mais plus le fragment est long, moins l’amplification est efficace et plus il est difficile d’obtenir des résultats cohérents. L’amplification de fragments très longs – jusqu’à 40 kb  est possible, mais nécessite des méthodes spéciales. La première question importante à aborder est la longueur des amorces. Si les amorces sont trop courtes, elles pourraient s’hybrider à des sites non cibles et donner des produits d’amplification indésirables. Pour illustrer ce point, imaginez que l’ADN humain total est utilisé dans une expérience de PCR avec une paire d’amorces de huit nucléotides de longueur (dans le jargon de la PCR, on parle de «8-mères»). Le résultat probable est qu’un nombre de fragments différents seront amplifiés. En effet, on s’attend à ce que les sites de fixation de ces amorces se produisent, en moyenne, une fois tous les 48 = 65 536 pb, ce qui donne approximativement 49 000 sites possibles dans   la séquence nucléotidique de 3 200 000 kb qui constitue le génome humain. Cela signifie qu’il serait très peu probable qu’une paire d’amorces 8-mères donnerait un seul produit d’amplification spécifique avec de l’ADN humain.

Que se passe-t-il si on utilise des amorces 17-mères ? La fréquence attendue d’une séquence 17-mères est une fois tous les 417 = 17 179 869 184 pb. Ce chiffre est plus de cinq fois supérieur à la longueur du génome humain, si bien qu’un amorce 17-mère devrait avoir un seul site d’hybridation dans l’ADN humain total. Une paire d’amorces 17-mer devrait donc donner un seul produit d’amplification spécifique . Pourquoi ne pas simplement faire les amorces aussi longtemps que possible? La longueur de l’amorce influe sur la vitesse à laquelle elle s’hybride à l’ADN matrice, les amorces longues s’hybridant à une vitesse plus lente. L’efficacité de la PCR, mesurée par le nombre de molécules amplifiées produites au cours de l’expérience, est donc réduite si les amorces sont trop longues, car une hybridation complète aux molécules matrices ne peut se produire dans le temps imparti pendant le cycle réactionnel. En pratique, les amorces plus longues que 30-mers sont rarement utilisées.

Working out the correct temperatures to use :

Au cours de chaque cycle de PCR, le mélange réactionnel est transféré entre trois températures:
1) La température de dénaturation, habituellement 94 ° C, qui casse les paires de bases et libère l’ADN monocaténaire pour servir de modèle pour la synthèse de nouvel ADN.

 2) La température d’hybridation ou de recuit, à laquelle les amorces se fixent l’ADN:

La température de recuit (hybridation) est la plus importante car, encore une fois, cela peut affecter la spécificité de la réaction. L’hybridation ADN-ADN est un phénomène. Si la température est trop élevée, aucune hybridation n’a lieu et au lieu de cela les amorces et les brins modèles restent dissociés. Toutefois, si la température est trop basse et peu correspondante, dans lesquels toutes les paires de bases formés sont stables et aussi les mismatches. Si cela se produit, les calculs antérieurs concernant les longueurs appropriées pour les amorces deviennent non pertinentes, car ces calculs supposaient que seuls les hybrides parfaits d’amorce-modèle peuvent se former. Si des  mismatches (inadéquations) sont tolérées, Le nombre de sites d’hybridation potentiels pour chaque amorce est grandement augmenté, et l’amplification est plus susceptible de se produire à des sites non cibles dans la molécule modèle.La température de recuit idéale doit être suffisamment faible pour permettre l’hybridation entre l’amorce et le model, mais suffisamment élevée pour empêcher les mismatches de former l’ADN.  Cette température peut être estimée en déterminant la melting température (fusion)  et ctte température ou  la Tm de l’hybride amorce-matrice. La Tm est la température à laquelle l’hybride correctement formé se dissocie. Une température de 1-2 °C  en dessous de cette température  être suffisamment faible pour permettre la formation de l’hybride primaire-modèle correctement, mais elle est trop elevée pour qu’ un hybride avec une seule inadéquation  puisse pas être stable. La Tm peut être déterminé expérimentalement mais  elle est souvent calculée à partir de la formule simple : Tm = (4 × [G + C]) + (2 × [A + T])°C  dans laquelle [G + C] est le nombre de nucléotides G et C dans la séquence d’amorce, et [A + T] est le nombre de nucléotides A et T. La température d’hybridation (recuit) pour une expérience de PCR est donc déterminée en calculant La Tm pour chaque amorce et en utilisant une température de 1-2 ° C en dessous de ce chiffre. Remarquez que cela signifie que les deux amorces doivent être conçues de telle sorte qu’elles aient des Tms identiques. Si ce n’est pas le cas, la température d’hybridation( recuit) appropriée pour une amorce peut être trop élevée ou trop faible pour l’autre amorce.

3) La température d’extension, à laquelle se produit la synthèse d’ADN. Il est généralement fixé à 74 ° C, juste en dessous de l’optimum pour la polymerase Taq.

 Les produits de PCR:

La PCR est souvent le point de départ d’une série d’expériences dans lesquelles le produit d’amplification est étudié de diverses manières afin d’obtenir des informations sur la molécule d’ADN qui a servi de modèle d’origine. Bien qu’un large éventail de procédures a été conçu pour étudier les produits de PCR, trois techniques sont particulièrement importantes:

l)  l’ électrophorèse sur gel des produits de PCR
2) Le clonage des produits de PCR
3) Le séquençage des produits de PCR.

 L’ électrophorèse sur gel des produits de PCR :

Les résultats de la plupart des expériences de PCR sont vérifiés en faisant tourner une partie du mélange réactionnel amplifié dans un gel d’agarose. Une bande représentant l’ADN amplifié peut être visible après coloration, ou si le rendement en ADN est faible, le produit peut être détecté par la méthode d’hybridation de Southern. Si la bande attendue est absente, ou si des bandes supplémentaires sont présentes, quelque chose a mal tourné et l’expérience doit être répétée. Dans certains cas, l’électrophorèse sur gel d’agarose est utilisée non seulement pour déterminer si une expérience de PCR a fonctionné, mais aussi pour obtenir des informations supplémentaires. Par exemple, la présence de sites de restriction dans la région amplifiée de l’ADN matrice peut être déterminée en traitant le produit de PCR avec une endonucléase de restriction avant de faire tourner l’échantillon dans le gel d’agarose.

 

 

Il s’agit d’un type d’analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction (RFLP) et est important à la fois dans la construction des cartes du génome et dans l’étude des maladies génétiques . D’autre part, la taille exacte du produit de PCR peut être utilisée pour établir si l’ADN matrice contient une mutation d’insertion ou de déletion dans la région amplifiée . Les mutations de longueur de ce type forment la base du profilage d’ADN, une technique centrale en médecine légale. Dans certaines expériences, la simple présence ou absence du produit de PCR est la caractéristique diagnostique. Un exemple est lorsque la PCR est utilisée comme procédé de criblage pour identifier un gène désiré à partir d’une banque génomique ou d’ADNc. La réalisation de PCR avec chaque clone dans une bibliothèque génomique peut sembler une tâche fastidieuse, mais un des avantages de la PCR est que les expériences individuelles sont rapides à mettre en place et de nombreuses PCR peuvent être effectuées en parallèle. La charge de travail peut également être réduite par un criblage combinatoire, dont un exemple est illustré à la figure.

 Clonage des produits de PCR :

Certaines applications nécessitent qu’après une PCR, les produits résultants soient ligaturés à un vecteur et examiné par l’une quelconque des méthodes standard utilisées pour étudier l’ADN cloné. Cela peut sembler facile, mais il y a des complications.

Le premier problème concerne les extrémités des produits de PCR. D’un examen de Figure ci dessous, on pourrait imaginer que les produits courts résultant de l’amplification par PCR Sont à extrémités franches. Si tel était le cas, ils pourraient être insérés dans un vecteur de clonage par une ligature à extrémités franches ou, en variante, les produits de PCR pourraient être munis d’extrémités collantes Par la fixation d’éléments de liaison ou d’adaptateurs .

 

 

Malheureusement, la situation n’est pas simple. La Taq polymerase tend à ajouter un nucleotide supplémentaire, habituellement une Adénosine, à la fin de chaque brin qu’il synthétise. Cela signifie qu’un produit double-brin de PCR n’est pas à extrémités franches, et la plupart des extrémités 3 ‘ ont une extrémité unique.

Les surplombs pourraient être enlevés par traitement avec une enzyme exonucléase, ce qui donne des produits de PCR avec de vraies extrémités franches, mais ce n’est pas Une approche populaire car il est difficile d’empêcher l’exonucléase de devenir hyperactive et provoquer des dommages supplémentaires aux extrémités des molécules.

Une solution consiste à utiliser un vecteur de clonage spécial qui porte des surplombs de thymidine (T) et qui peut donc être ligaturé à un produit de PCR .

Ces vecteurs sont Habituellement préparé en restreignant un vecteur standard au niveau d’un site à extrémités franches, puis en traitant Avec Taq polymerase en présence de 2′-désoxythymidine 5′-triphosphate (dTTP). Aucune amorce n’est présente ainsi la seule chose que la polymérase puisse faire est d’ajouter un nucléotide T aux extrémités 3 ‘ de la molécule de vecteur à extrémités franches, ce qui a pour résultat le vecteur à queue T dans lequel la PCR Produits peuvent être insérés. Des vecteurs spéciaux de ce type ont également été conçus pour être utilisés avec la méthode de ligation de la topoisomérase, et c’est actuellement  La méthode la plus populaire de clonage des produits PCR.

Une seconde solution consiste à concevoir des amorces qui contiennent des sites de restriction. Après la PCR, les produits sont traités par l’endonucléase de restriction, qui coupe chaque molécule à l’intérieur de la séquence d’amorce, laissant des fragments à extrémité collante qui peuvent être ligaturés efficacement dans un vecteur de clonage standard. L’approche ne se limite pas aux cas où les amorces s’étendent sur des sites de restriction qui sont présents dans l’ADN matrice. Au lieu de cela, le site de restriction peut être inclus dans une courte extension à l’extrémité 5′ de chaque amorce. Ces extensions ne peuvent pas s’hybrider à la molécule modèle, Mais ils sont copiés au cours de la PCR, résultant en produits de PCR qui portent des terminaux avec des sites de restrictio

Problèmes avec le taux d’erreur de Taq polymérase :

Toutes les ADN polymérases font des erreurs pendant la synthèse de l’ADN, en introduisant des nucléotides incorrects dans le brin d’ADN croissant. La plupart des polymérases, cependant, sont capable de corriger ces erreurs en inversant l’erreur et en re-synthétisant les séquence. Cette propriété est appelée fonction « relecture » et dépend de la polymérase possédant une activité exonucléase 3′ à 5′. La Taq polymérase manque d’une activité de correction d’épreuves et, par conséquent, est incapable de corriger ses erreurs. Cela signifie que l’ADN synthétisé par la Taq polymérase n’est pas toujours une copie exacte de la molécule modèle. Le taux d’erreur a été estimé à une erreur pour chaque 9000 nucléotides d’ADN qui est synthétisé, ce qui pourrait sembler être presque Insignifiant mais qui se traduit par une erreur dans chaque 300 pb pour les produits PCR obtenu après 30 cycles. C’est parce que la PCR implique des copies de copies, de sorte que les erreurs induites par la polymérase s’accumulent progressivement, les fragments produits à la fin d’une PCR contenant des copies d’erreurs antérieures ainsi que de nouvelles erreurs présenté lors de la dernière ronde de synthèse. Pour de nombreuses applications, ce taux d’erreur élevé ne pose pas de problème. En particulier, le séquençage d’un produit de PCR fournit la séquence correcte du modèle, même si les produits de PCR contiennent les erreurs introduites par la Taq polymérase. C’est parce que les erreurs sont réparties aléatoirement, donc pour chaque molécule qui a une erreur à un nucléotide, il y aura de nombreuses molécules avec la séquence correcte. Dans ce contexte le taux d’erreur est en effet insignifiant. Ce n’est pas le cas si les produits PCR sont clonés. Chaque clone résultant contient plusieurs copies d’un seul fragment amplifié, de sorte que l’ADN cloné n’a pas nécessairement la même séquence que la molécule modèle d’origine utilisée dans la PCR. Cette possibilité confère une incertitude à toutes les expériences réalisées avec les produits clonées de PCR et dicte que, chaque fois que c’est  possible, l’ADN amplifié doit être étudié directement au lieu d’être cloné.

La PCR en temps réel permet de quantifier la quantité de matière de départ :

The amount of product that is synthesized during a set number of cycles of a PCR
depends on the number of DNA molecules that are present in the starting mixture
(Table 9.1). If there are only a few DNA molecules at the beginning of the PCR then
relatively little product will be made, but if there are many starting molecules then the
product yield will be higher. This relationship enables PCR to be used to quantify the
number of DNA molecules present in an extract.
Table 9.1
Number of short products synthesized after 25 cycles of PCR with different numbers of starting molecule.
NUMBER OF STARTING MOLECULES NUMBER OF SHORT PRODUCTS
1 4,194,304
2 8,388,608
5 20,971,520
10 41,943,040
25 104,857,600
50 209,715,200
100 419,430,400
Test 1 2 3 4
9.4.1 Carrying out a quantitative PCR experiment
In quantitative PCR (qPCR) the amount of product synthesized during a test PCR is
compared with the amounts synthesized during PCRs with known quantities of starting
DNA. In the early procedures, agarose gel electrophoresis was used to make these
comparisons. After staining the gel, the band intensities were examined to identify the
control PCR whose product was most similar to that of the test (Figure 9.17). Although
easy to perform, this type of qPCR is imprecise, because large differences in the amount
of starting DNA give relatively small differences in the band intensities of the resulting
PCR products.
Today, quantification is carried out by real-time PCR, a modification of the standard
PCR technique in which synthesis of the product is measured over time, as the PCR
proceeds through its series of cycles. There are two ways of following product synthesis
in real time:
l A dye that gives a fluorescent signal when it binds to double-stranded DNA
can be included in the PCR mixture. This method measures the total amount of
double-stranded DNA in the PCR at any particular time, which may over-estimate
the actual amount of the product because sometimes the primers anneal to one
another in various non-specific ways, increasing the amount of double-stranded
DNA that is present.
l A short oligonucleotide called a reporter probe, which gives a fluorescent signal
when it hybridizes to the PCR product, can be used. Because the probe only
hybridizes to the PCR product, this method is less prone to inaccuracies caused by
primer-primer annealing. Each probe molecule has pair of labels. A fluorescent dye
Chapter 10 The Polymerase Chain Reaction 159
Figure 9.17
Using agarose gel electrophoresis to quantify the amount
of DNA in a test PCR. Lanes 1 to 4 are control PCRs
carried out with decreasing amounts of template DNA.
The intensity of staining for the test band suggests that
this PCR contained approximately the same amount of
DNA as the control run in lane 2.
Note: The numbers assume that amplification is 100% efficient, none of the reactants becoming limiting during the course of the PCR.
Quenching
compound
Fluorescent
label
Fluorescent
signal
Probe
Oligonucleotide
probe
DNA target
DNA
Figure 9.18
Hybridization of a reporter probe to its target DNA.
Amount of PCR product
Number of cycles
Threshold
Figure 9.19
Quantification by real-time PCR. The graph shows
product synthesis during three PCRs, each with a
different amount of starting DNA. During a PCR, product
accumulates exponentially, the amount present at any
particular cycle proportional to the amount of starting
DNA. The blue curve is therefore the PCR with the
greatest amount of starting DNA, and the green curve is
the one with the least starting DNA. If the amounts of
starting DNA in these three PCRs are known, then the
amount in a test PCR can be quantified by comparison
with these controls. In practice, the comparison is made
by identifying the cycle at which product synthesis
moves above a threshold amount, indicated by the
horizontal line on the graph.
is attached to one end of the oligonucleotide, and a quenching compound, which
inhibits the fluorescent signal, is attached to the other end (Figure 9.18). Normally
there is no fluorescence because the oligonucleotide is designed in such a way that
its two ends base pair to one another, placing the quencher next to the dye.
Hybridization between the oligonucleotide and the PCR product disrupts this base
pairing, moving the quencher away from the dye and enabling the fluorescent
signal to be generated.
Both systems enable synthesis of the PCR product to be followed by measuring the
fluorescent signal. Quantification again requires comparison between test and control
PCRs, usually by identifying the stage in the PCR at which the amount of fluorescent
signal reaches a pre-set threshold (Figure 9.19). The more rapidly the threshold is
reached, the greater the amount of DNA in the starting mixture.
9.4.2 Real-time PCR can also quantify RNA
Real-time PCR is often used to quantify the amount of DNA in an extract, for example
to follow the progression of a viral infection by measuring the amount of pathogen DNA
that is present in a tissue. More frequently, however, the method is used as a means of
measuring RNA amounts, in particular to determine the extent of expression of a
particular gene by quantifying its mRNA. The gene under study might be one that is
switched on in cancerous cells, in which case quantifying its mRNA will enable the
160 Part I The Basic Principles of Gene Cloning and DNA Analysis
Standard PCR

Ces vectors de clonage ont été développés dans les années 80 et leur utilisation a conduit à la  culture des OGM (organismes génétiquement modifiées). Trois types de vecteurs ont été utilisés avec plus ou moins de succès pour le clonage des  Plantes :

1.  Vecteurs à base de plasmides naturels d’Agrobacterium.
2. Transfert direct de gène en utilisant différents types d’ADN plasmidique.

3. Vecteurs à base de virus végétaux.

Agrobacterium tumefaciens – le plus petit ingénieur génétique de la nature :

Bien qu’aucun plasmide naturel ne soit connu dans les plantes supérieures, un plasmide  bactérien, le plasmide Ti d’Agrobacterium tumefaciens, est d’une grande importance. A. tumefaciens est un micro organisme du sol qui cause la maladie de la galle du collet chez de nombreuses espèces de plantes dicotylédones. La gale de la couronne se produit lorsqu’une plaie sur la tige permet  à la bactérie A.Tumefaciens d’envahir la plante. Après l’infection, les bactéries provoquent une prolifération du tissu de la tige dans la région de la couronne. La capacité de causer la maladie de la galle de la couronne est associée à la présence du plasmide Ti (tumeur Induisant) dans la cellule bactérienne. Il s’agit d’un grand plasmide (plus de 200 kb) qui porte de nombreux gènes impliqués dans le processus infectieux. Une caractéristique remarquable du plasmide Ti est que, après infection, une partie de la molécule est intégrée dans l’ADN chromosomique de la plante . Ce segment, appelé T-ADN, est  entre 15 et 30 kb, selon la souche. Il est maintenu sous une forme stable dans la cellule végétale et est transmise à des cellules filles en tant que partie intégrante des chromosomes.

 

Mais la caractéristique la plus remarquable du plasmide Ti est que l’ADN-T contient Huit gènes qui sont exprimés dans la cellule végétale et sont responsables des  Propriétés cancereuses des cellules transformées. Ces gènes dirigent également la synthèse de Composés, appelés opines, que les bactéries utilisent comme nutriments. En bref, A. tumefaciens  modifie génétiquement la cellule végétale pour ses propres fins.

Utilisation du plasmide Ti pour introduire de nouveaux gènes dans une cellule végétale :

Il a été réalisé très rapidement que le plasmide Ti pouvait être utilisé pour transporter de nouveaux gènes dans des cellules végétales. Tout ce qui serait nécessaire serait d’insérer les nouveaux gènes dans l’ADN-T et ensuite la bactérie pourrait faire le travail acharné pour les intégrer dans l’ADN chromosomique de la plante. En pratique, cela s’est avéré une proposition délicate, principalement parce que la grande taille du plasmide Ti rend la manipulation de la molécule très difficile. Le problème principal est, bien entendu, qu’un site de restriction unique est impossible avec un plasmide de 200 kb. De nouvelles stratégies doivent être développées pour l’insertion d’un nouvel ADN  dans le plasmide. Les deux techniques suivantes  sont actuellement utilisées :

La stratégie du vecteur binaire :

elle est basée sur l’observation que le L’ADN-T n’a pas besoin d’être physiquement fixé au reste du plasmide Ti. Un système à deux plasmides, avec l’ADN-T sur une molécule relativement petite, et le reste sur un plasmide sous sa forme normale, est tout aussi efficace à la transformation des cellules végétales. En fait, certaines souches de A. tumefaciens et les autres agro-bactéries de la famille ont normalement des  systèmes plasmidiques binaires. Le plasmide T-ADN est suffisamment petit pour avoir un seul site de restriction et d’être manipulé en utilisant des techniques standards.

La stratégie de co-intégration:

celle-ci  utilise un plasmide entièrement nouveau, basée sur un vecteur d’E. coli, mais portant une petite partie de l’ADN-T. L’homologie entre la nouvelle molécule et le plasmide Ti signifie que si les deux sont présents dans la même cellule d’ A. tumefaciens, la recombinaison peut intégrer le plasmide E. coli dans La région T-ADN. Le gène à cloner est donc inséré dans un site de restriction sur le petit plasmide E. coli, introduit dans des cellules de A. tumefaciens Portant un plasmide Ti, et le processus de recombinaison naturelle fait le nécessaire pour intégrer le nouveau gène dans l’ADN-T. L’infection de la plante conduit à l’insertion du nouveau gène, avec le reste de l’ADN-T, dans les chromosomes végétaux.

 

Production de plantes transformées avec le plasmide Ti:

Si des A. tumefaciens contenant un plasmide Ti modifié sont introduites dans une plante d’une manière naturelle, par l’infection d’une plaie dans la tige, alors seules les cellules de la galle de la couronne résultante posséderont le gène cloné. Cela évidemment est de faible valeur pour le biotechnologiste. Au lieu de ça, l’introduction du nouveau gène dans chaque cellule de la plante est nécessaire. Il existe plusieurs solutions, la plus simple étant d’infecter non pas la plante mature mais plutôt la culture de cellules végétales ou de protoplastes en milieu liquide. Les cellules végétales et les protoplastes dont les parois cellulaires se sont formés peuvent être traités de la même manière que les micro-organismes: par exemple, ils peuvent être cultivées sur un milieu sélectif pour isoler les transformants. Une plante mature régénérée à partir de cellules transformées contiendra le gène cloné dans chaque cellule et passera le gène cloné à sa progéniture. cependant, La régénération d’une plante transformée ne peut se produire que si le vecteur Ti a été « désarmé » De sorte que les cellules transformées ne présentent pas de propriétés cancéreuses. Le désarmement est possible Parce que les gènes du cancer, qui sont tous dans l’ADN-T, ne sont pas nécessaires pour l’infection , L’infectiosité étant contrôlée principalement par la région de virulence du Ti plasmide. En fait, les seules parties de l’ADN-T qui sont impliquées dans l’infection sont deux séquences de répétitions de 25 pb trouvées aux frontières gauche et droite de la région L’ADN de la plante. Tout ADN placé entre ces deux séquences répétées sera traité comme « T-ADN » et transféré à la plante. Il est donc possible d’éliminer tous les gènes de cancers de l’ADN-T normal, et de les remplacer par un ensemble entièrement nouveau de gènes, Sans perturber le processus d’infection. Un certain nombre de vecteurs de clonage Ti désarmés sont maintenant disponibles, un exemple typique étant Le vecteur binaire pBIN19.

 

Les frontières de T-ADN gauche et droite Ce vecteur flanque une copie du gène lacZ ‘, contenant un certain nombre de sites de clonage, et un Gène de résistance à la kanamycine qui fonctionne après l’intégration des séquences Le chromosome végétal. Comme avec un vecteur navette de levure, les manipulations initialesQui entraînent l’insertion du gène à cloner dans pBIN19 sont réalisées dans E. coli, La molécule recombinante pBIN19 recombinante étant alors transférée à A. tumefaciens et De là dans la plante. Les cellules végétales transformées sont sélectionnées par étalement sur un milieu gélose Contenant de la kanamycine.

Le plasmide Ri :

Au fil des ans, il y a eu également un intérêt à développer des vecteurs de clonage basés sur le plasmide Ri d’Agrobacterium rhizogenes. Les plasmides Ri et Ti sont très semblables et la principale différence étant que le transfert de l’ADN-T d’un plasmide Ri à une plante a pour résultat non pas  une galle de la couronne mais plutot  la maladie des racines poilues, caractérisées par une racine très ramifiée. La possibilité de cultiver des racines transformées dans une culture liquide à haute densité a été exploré comme un moyen potentiel de produire des grandes quantités de protéines à partir de gènes clonés dans ces plantes.

Les limites du clonage avec des plasmides d’Agrobacterium :

Les plantes supérieures sont divisées en deux grandes catégories, les monocotylédones et les dicotylédones. Plusieurs facteurs se sont combinés pour rendre beaucoup plus facile le clonage de gènes chez les dicotylédones (la tomate, le tabac, la pomme de terre, les pois et les haricots) mais beaucoup plus difficile d’obtenir les mêmes résultats avec les monocotylédones. Cela a été frustrant parce les monocotylédones comprennent le (blé, L’orge, le riz et le maïs), qui sont les plantes de culture les plus importantes et donc les Cibles souhaitables pour les projets d’ingénierie génétique. La principale difficulté vient du fait que dans la nature l’A. tumefaciens et A. rhizogenes Infectent uniquement les plantes dicotylédones; Les monocotylédones sont en dehors de la gamme normale d’hôtes. Pendant quelque temps, on a pensé que cette barrière naturelle était insurmontable et que les Monocotylédones étaient totalement résistantes à la transformation avec des vecteurs Ti et Ri, mais finalement Des techniques artificielles pour réaliser le transfert d’ADN-T ont été imaginées. La transformation avec un vecteur d’Agrobacterium normalement Implique la régénération d’une plante intacte à partir d’un protoplaste, d’une cellule ou d’un calus transformés en Culture. La facilité avec laquelle une plante peut être régénérée dépend beaucoup des espèces particulières concernées et, encore une fois, les plantes les plus difficiles sont les monocotylédones. Les tentatives pour contourner ce problème se sont concentrées sur l’utilisation de bombardement biologique avec des microprojectiles pour introduire directement l’ADN plasmidique dans les embryons végétaux. Bien qu’il s’agisse d’une procédure de transformation assez violente, semblant trop dommageable pour les embryons,  en réalité ces derniers  continuent leur développement normal Pour produire des plantes matures. L’approche a été couronnée de succès avec le maïs Et plusieurs autres monocotylédones importantes.

Transfert direct de gènes:

Transfert direct de gènes dans le noyau:

Le transfert direct de gènes est basé sur l’observation, d’abord faite en 1984, qu’un plasmide bactérien super-enroulé, bien qu’il ne soit pas capable de se reproduire seul dans une cellule végétale, puisse être intégré par recombinaison dans l’un des chromosomes végétaux. L’événement de recombinaison est mal compris mais est presque certainement distinct des processus responsables de l’intégration d’ADN-T. Elle est également distincte de l’intégration chromosomique d’un vecteur de levure, car il n’existe aucune exigence pour une région de similarité entre le plasmide bactérien et l’ADN végétal. En fait, l’intégration semble se produire de façon aléatoire à n’importe quelle position dans n’importe lequel des chromosomes végétaux. Le transfert direct de gène utilise donc un ADN de plasmide super-enroulé, éventuellement un plasmide bactérien simple, dans lequel un marqueur sélectionnable approprié (par exemple, un gène de résistance à kanamycine) et le gène à cloner ont été insérés. La biolistique est fréquemment utilisée pour introduire l’ADN plasmidique dans des embryons végétaux, mais si l’espèce à cloner Peut être régénérée à partir de protoplastes ou des cellules uniques, alors d’autres stratégies, éventuellement plus efficaces que la biolistique, sont possibles. Un procédé consiste à remettre en suspension des protoplastes dans une solution visqueuse de polyéthylèneglycol, un composé polymère chargé négativement qui est censé précipiter l’ADN sur les surfaces des protoplastes et induire une absorption par endocytose (figure 7.16).

L’électroporation est également utilisée pour augmenter la fréquence de transformation. Après traitement, les protoplastes sont laissés pendant quelques jours dans une solution qui favorise la régénération des parois cellulaires. Les cellules sont ensuite étalées sur un milieu sélectif pour identifier les transformants et pour fournir des cultures de cals à partir desquelles des plantes intactes peuvent être cultivées (exactement comme décrit pour le système d’Agrobacterium).

Transfert de gènes dans le génome des chloroplastes :

Si la biolistique est utilisée pour introduire l’ADN dans un embryon végétal, certaines particules peuvent pénétrer un ou plusieurs des chloroplastes présents dans les cellules. Les chloroplastes contiennent leur propre génome, distinct et beaucoup plus court que les molécules d’ADN du noyau, et dans certaines circonstances, l’ADN plasmidique peut s’intégrer dans ce génome du chloroplaste. Contrairement à l’intégration de l’ADN dans les chromosomes nucléaires, l’intégration dans le génome des chloroplastes ne se produira pas de façon aléatoire. Au lieu de cela, l’ADN à cloner doit être flanqué de séquences similaires à la région du génome du chloroplaste dans laquelle l’ADN doit être inséré, de sorte que l’insertion peut avoir lieu par recombinaison homologue.
Chacune de ces séquences flanquantes doit avoir une longueur d’environ 500 pb. Un faible niveau de transformation du chloroplaste peut également être obtenu après l’administration d’ADN induite par PEG dans des protoplastes si le plasmide qui est prélevé porte ces séquences flanquantes. Une cellule végétale contient des dizaines de chloroplastes, et probablement seulement une par cellule devient transformée, de sorte que l’ADN inséré doit porter un marqueur sélectionnable tel que le gène de résistance à la kanamycine, et les embryons doivent être traités avec l’antibiotique pendant une période considérable pour s’assurer que Les génomes transformés se propagent dans la cellule. Bien que cela signifie que la transformation des chloroplastes est une méthode difficile à mettre en œuvre avec succès, elle pourrait devenir un adjuvant important aux méthodes plus traditionnelles pour obtenir des cultures OGM. Comme chaque cellule possède de nombreux chloroplastes, mais seulement un noyau, un gène inséré dans le génome du chloroplaste est susceptible d’être exprimé à un niveau supérieur à celui placé dans le noyau. Ceci est particulièrement important lorsque les plantes modifiées doivent être utilisées pour la production de protéines pharmaceutiques. Jusqu’à présent, l’approche a été la plus réussie avec le tabac, mais la transformation des chloroplastes a également été réalisée avec des cultures plus utiles comme le soja et le coton.

Utilissation des virus végétaux comme vecteurs de clonage :

Les versions modifiées des bactériophages λ et M13 sont des vecteurs de clonage importants pour E. coli. La plupart des plantes sont sujettes à une infection virale, est ce que les virus pourraient être utilisés pour cloner les gènes dans les plantes? Si elles le pouvaient, elles seraient beaucoup plus pratiques à utiliser que d’autres types de vecteurs, car avec de nombreux virus la transformation peut être obtenue simplement en frottant l’ADN du virus sur la surface d’une feuille. Le processus d’infection naturelle répand ensuite le virus dans toute la plante. Le potentiel des virus végétaux comme vecteurs de clonage a été exploré pendant plusieurs années, mais sans grand succès. Un problème est que la grande majorité des virus végétaux ont des génomes non d’ADN mais d’ARN. Les virus à ARN ne sont pas aussi utiles que les vecteurs de clonage potentiels car les manipulations avec l’ARN sont plus difficiles à réaliser. Seules deux classes de virus à ADN sont connues pour infecter des plantes supérieures, les caulimovirus et les geminivirus, et aucune d’entre elles n’est idéalement adaptée au clonage de gènes.

Les vecteurs à Caulimovirus :

Bien que l’une des premières expériences réussies d’ingénierie génétique végétale, en 1984, a utilisé un vecteur de caulimovirus pour cloner un nouveau gène dans des plantes de navet, deux difficultés générales avec ces virus ont limité leur utilité. La première est que la taille totale d’un génome de caulimovirus est, comme celle de e, contrainte par la nécessité de l’emballer dans sa couche de protéine. Même après la suppression de sections non essentielles du génome viral, la capacité de transporter l’ADN inséré est encore très limitée. Des recherches récentes ont montré qu’il serait possible de contourner ce problème en adoptant une stratégie de virus auxiliaire, semblable à celle utilisée avec les phagemides . Dans cette stratégie, le vecteur de clonage est un génome du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) qui manque de plusieurs des gènes essentiels, ce qui signifie qu’il peut transporter un gros segment d’ADN mais ne peut pas par lui-même causer une infection directe. Les plantes sont inoculées avec l’ADN vecteur avec un génome CaMV normal. Le génome viral normal fournit les gènes nécessaires pour que le vecteur de clonage soit emballé dans des protéines virales et se propage à travers la plante. Cette approche a un potentiel considérable, mais ne résout pas le deuxième problème, qui est la gamme extrêmement étroite de l’hôte de caulimovirus. Cela limite les expériences de clonage à quelques plantes seulement, principalement des champignons tels que les navets, les choux et les choux-fleurs. Les caulimovirus ont toutefois joué un rôle important dans le génie génétique comme source de promoteurs très actifs qui fonctionnent dans toutes les plantes et qui sont utilisés pour obtenir l’expression de gènes introduits par clonage de plasmide Ti ou transfert de gène direct.

Les vecteurs à Geminivirus:

Ceux-ci sont particulièrement intéressants parce que leurs hôtes naturels comprennent des plantes telles que le maïs et le blé, et ils pourraient donc être des vecteurs potentiels pour ces monocotylédones et d’autres. Mais les geminivirus ont présenté leur propre série de difficultés, un problème étant que pendant le cycle d’infection, les génomes de certains geminivirus subissent des réarrangements et des déletions, ce qui entraînerait un quelconque ADN supplémentaire qui a été inséré, un désavantage évident pour un vecteur de clonage. La recherche au fil des ans a abordé ces problèmes, et les geminivirus commencent à trouver des applications spécialisées dans le clonage de gènes de plantes. L’un d’entre eux est le séquençage génique induit par virus (VIGS), une technique utilisée pour étudier les fonctions des gènes de plantes individuelles. Cette méthode exploite l’un des mécanismes de défense naturelle que les plantes utilisent pour se protéger contre les attaques virales. Cette méthode, appelée ARN silencieux, entraîne une dégradation des ARNm viraux. Si l’un des ARN viraux est transcrit à partir d’un gène cloné contenu dans un génome de geminivirus, alors non seulement les transcrits viraux mais aussi les ARNm cellulaires dérivés de la copie du gène de la plante sont dégradés (figure 7.17). Le gène végétal devient donc silencieux et l’effet de son inactivation sur le phénotype de la plante peut être étudié.

La levure Saccharomyces cerevisiae est l’un des organismes les plus importants dans la biotechnologie. Outre son rôle dans le brassage et la fabrication du pain, la levure a été utilisé comme un organisme hôte pour la production de produits pharmaceutiques importants à partir de gènes clonés. Dans un premier temps le développement des vecteurs de clonage de la levure, a été stimulée, par la découverte d’un plasmide qui est présent dans la plupart des souches de S. cerevisiae. Le 2 µ plasmide, comme on l’appelle, est l’un des rares plasmides trouvés dans les cellules eucaryotes.

 

Les marqueurs sélectionnables pour le  plasmide 2 µm:

Le plasmide de 2 µm est un excellent élément pour un vecteur de clonage. Il a une taille de 6 kb, ce qui est idéal pour un vecteur et existe dans la cellule de levure à un nombre de copies compris entre 70 et 200. La réplication utilise une origine de plasmide, plusieurs enzymes fournies par la cellule hôte et les protéines codées Par les gènes REP1 et REP2 portés par le plasmide. Cependant, tout n’est pas parfaitement simple dans l’utilisation du plasmide de 2 μm comme vecteur de clonage. Tout d’abord, il y a la question d’un marqueur sélectionnable. Certains vecteurs de clonage de levure portent des gènes conférant une résistance aux inhibiteurs tels que le méthotrexate et le cuivre, mais la plupart des vecteurs de levure populaires utilisent un type de sélection radicalement différent.

 

 

En pratique, on utilise un gène de levure normal, généralement celui qui code pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse des acides aminés. Un exemple est le gène LEU2, qui code pour la b-isopropyl-malate déshydrogénase, l’une des enzymes impliquées dans la conversion de l’acide pyruvique en leucine. Afin d’utiliser le LEU2 comme marqueur de sélection, un type particulier d’organisme hôte est nécessaire. L’hôte doit être un mutant auxotrophique qui possède un gène LEU2 non fonctionnel. Une telle levure leu2-  est incapable de synthétiser la leucine et ne peut survivre que si cet acide aminé est fourni comme nutriment dans le milieu de croissance . La sélection est possible parce que les transformants contiennent une copie du gène LEU2 supportée par un plasmide et sont ainsi capables de se développer en l’absence de l’acide aminé. Dans une expérience de clonage, les cellules sont étalées sur un milieu minimal, qui ne contient pas d’acides aminés ajoutés. Seules les cellules transformées sont capables de survivre et de former des colonies.

 

Les vecteurs basés sur le plasmide 2 µm – les plasmides  épisomiques :

Les vecteurs dérivés du plasmide de 2 μm sont appelés plasmides épisomiques de levure (YEps=yeast episomal plasmids). Quelques YEps contiennent le plasmide  de 2 µm en entier, d’autres incluent juste l’origine de réplication de 2 μm. Un exemple de ce dernier type est YEp13. YEp13 illustre plusieurs caractéristiques générales de vecteurs de clonage de levure. Tout d’abord, il s’agit d’un vecteur navette. Outre l’origine de replication de 2 μm et le gène LEU2 sélectionnable, YEp13 inclut également la séquence entière de pBR322, et peut donc se répliquer et être sélectionné pour à la fois dans la levure et dans E. coli.

Il ya plusieurs lignes de raisonnement derrière l’utilisation des vecteurs navette. L’une est qu’il pourrait être difficile de récupérer la molécule d’ADN recombinant d’une colonie de levure transformée. Ce n’est pas un tel problème avec YEps, qui sont présents dans les cellules de levure principalement sous forme de plasmides, mais avec d’autres vecteurs de levure, qui peuvent s’intégrer dans un des chromosomes de levure, la purification pourrait être impossible. Ceci est un inconvénient car, dans de nombreuses expériences de clonage, la purification de l’ADN recombinant est essentielle pour que la construction correcte soit identifiée par exemple par séquençage d’ADN. La procédure standard lors du clonage dans la levure est donc d’effectuer l’expérience de clonage initiale avec E. coli et de sélectionner des recombinants dans cet organisme. Les plasmides recombinants peuvent ensuite être purifiés, caractérisés et la molécule correcte Introduite dans la levure.

 Un YEp peut s’insérer dans l’ADN chromosomique de levure

Le mot «épisomale» indique qu’un YEp peut se répliquer en tant que plasmide indépendant, mais implique également l’intégration dans l’un des chromosomes de levure (voir la définition de «épisome»). L’intégration se produit parce que le gène porté sur le vecteur comme marqueur de sélection est très similaire à la version mutante du gène présent dans l’ADN chromosomique de levure. Avec YEp13, par exemple, une recombinaison homologue peut se produire entre le gène du plasmide LEU2 et le gène LEU2 du mutant de levure, provoquant l’insertion du plasmide entier dans l’un des chromosomes de levure. le Plasmide peut rester intégré, ou un événement de recombinaison ultérieur peut l’excisé de nouveau.

Autres types de vecteur de clonage de levure :

En plus des YEps , il existe plusieurs autres types de vecteurs de clonage à utiliser avec S.cerevisiae. Les deux plus importants sont les suivantes:

A) Les plasmides intégrés dans la levure (YIps = Yeast integrative plasmids ) sont essentiellement des plasmides bactériens portant un gène de levure. Un exemple est YIp5, qui est le pBR322 avec un gène URA3 inséré.

Ce gène code pour l’orotidine-5′-phosphate décarboxylase (une enzyme qui catalyse une des étapes de la voie de biosynthèse pour les nucleotides pyrimidiques) et est utilisée comme marqueur sélectionnable exactement de la même manière que LEU2. Un YIp ne peut pas se répliquer en tant que plasmide car il ne contient aucune partie du plasmide 2 µm et dépend plutôt pour sa survie de son intégration dans l’ADN chromosomique de levure. L’intégration se produit juste comme décrit pour un YEp.

B) Plasmides réplicatifs de levure (YRps=Yeast replicative plasmids )

Ils sont  capables de se multiplier en tant que plasmides indépendants parce qu’ils portent une séquence d’ADN chromosomique qui comprend une origine de réplication. Les origines de réplication sont connues pour être situées très près de plusieurs des gènes de levure, comprenant un ou deux qui peuvent être utilisés comme marqueurs sélectionnables. YRp7  est un exemple de plasmide réplicatif. Il est composé de pBR322 plus le gène de levure TRP1. Ce gène, impliqué dans la biosynthèse du tryptophane, est situé adjacent à une origine chromosomique de réplication.

Le fragment d’ADN de levure présent dans YRp7 contient TRP1 et l’origine de réplication. Trois facteurs entrent en jeu pour décider quel type de vecteur de levure est le plus approprié pour une expérience de clonage particulière:

La première est la fréquence de transformation : une mesure du nombre de transformants qui peuvent être obtenus par microgramme de plasmidique. Une fréquence de transformation élevée est nécessaire si un grand nombre de recombinants sont nécessaires, ou si l’ADN de départ est insuffisant. YEps ont le plus haut fréquence de transformation, fournissant entre 10 000 et 100 000 cellules transformées Par µg. YRps sont également assez productifs, donnant entre 1000 et 10 000 transformants par µg, mais un YIp donne moins de 1000 transformants par µg et seulement 1-10 à moins que des procédures spéciales sont utilisées. La faible fréquence de transformation d’un YIp reflète que l’événement d’intégration chromosomique (qui est assez rare) est nécessaire avant que le vecteur puisse être conservé dans une cellule de levure.

Le deuxième facteur important est le nombre de copies. YEps et YRps ont le nombre de copie le plus élevé, 20-50 et 5-100, respectivement. En revanche, un YIp est habituellement présent à une seule copie par cellule. Ces chiffres sont importants si l’objectif est d’obtenir des protéines par le gène cloné, plus il y a de copies du gène, plus élevé sera le rendement attendu du produit protéique.
Alors pourquoi voudrait-on utiliser un YIp? La réponse est que YIps produit des recombinants très stables, comme la perte d’un YIp qui est devenu intégré dans un chromosome ne se produit qu’à une très faible fréquence. En revanche, les recombinants YRp sont extrêmement instables,les plasmides tendant à se rassembler dans la cellule mère lorsqu’une cellule fille se déclenche, la cellule fille n’est pas recombinante. Les recombinants YEp souffrent de problèmes similaires, bien qu’une meilleure compréhension de la biologie du plasmide de  2 µm ait permis de développer des YEps plus stable ces dernières années. Néanmoins, un YIp est le vecteur de choix si les besoins de l’expérience exigent que les cellules de levure recombinantes retiennent  le gène cloné pendant de longues périodes en culture.

Les chromosomes artificiels peuvent être utilisés pour cloner de longs morceaux d’ADN dans des levures :

Le dernier type de vecteur de clonage de levure à considérer est le chromosome artificiel de levure (YAC), qui présente une approche totalement différente au clonage de gène. Le développement des YAC a été un spin-off de la recherche fondamentale sur la structure des chromosomes eucaryotes, le travail qui a identifié les composants clés d’un chromosome comme étant:

– le centromère, qui est nécessaire pour que le chromosome soit réparti correctement aux cellules filles pendant la division cellulaire;
– deux télomères, les structures aux extrémités d’un chromosome qui sont nécessaires pour que les extrémités soient correctement reproduites et qui empêchent également le chromosome d’être grignoté par les exonucléases;
– les origines de la réplication, qui sont les positions le long du chromosome à l’origine de la réplication de l’ADN, similaire à l’origine de la réplication d’un plasmide.
Une fois que la structure chromosomique a été définie de cette manière, la possibilité est apparue que les composants individuels puissent être isolés par des techniques d’ADN recombinant, puis rejoints ensemble dans le tube à essai, créant un chromosome artificiel. Comme les molécules d’ADN présentes dans les chromosomes naturels de levure ont plusieurs centaines de kilobases de longueur, il serait possible avec un chromosome artificiel de cloner de longs morceaux d’ADN.

La structure et l’utilisation d’un vecteur YAC

Plusieurs vecteurs YAC ont été développés mais chacun est construit selon le même schémas, le pYAC3 étant un exemple typique. À première vue, pYAC3 ne ressemble pas beaucoup à un chromosome artificiel mais en examinant de plus près ses caractéristiques uniques apparaissent. pYAC3 est essentiellement un plasmide pBR322 dans lequel un certain nombre de gènes de levure ont été insérés. Deux de ces gènes, URA3 et TRP1, ont déjà été rencontrés comme marqueurs sélectionnables pour YIp5 et YRp7, respectivement. Comme dans YRp7, le fragment d’ADN qui porte TRP1 contient également une origine de replication, mais dans pYAC3 ce fragment est étendu encore plus pour inclure la séquence appelée CEN4, qui est l’ADN provenant de la région centromère du chromosome 4. Le fragment (TRP1-origine- CEN4) contient donc deux des trois composants du chromosome artificiel. Le troisième composant, les télomères, est fourni par les deux séquences appelées TEL. Ce ne sont pas des séquences de télomères complètes, mais une fois à l’intérieur du noyau de levure, ils agissent comme des séquences d’ensemencement sur lesquelles les télomères seront construits. Il reste juste une autre partie de pYAC3 qui n’a pas été mentionnée: SUP4, qui est le marqueur sélectionnable dans lequel le nouvel ADN  est inséré pendant l’expérience de clonage.

 

La stratégie de clonage avec pYAC3 est la suivante. Le vecteur est d’abord restreint avec une combinaison de BamHI et SnaBI, coupant la molécule en trois fragments. Le fragment flanqué de sites BamHI est jeté, laissant deux bras, chacun limité par une séquence TEL et un site SnaBI. L’ADN à cloner, qui doit avoir des extrémités émoussées (SnaBI est un cutter d’extrémité émoussée, reconnaissant la séquence TACGTA), est ligaturé entre les deux bras, produisant le chromosome artificiel.

 

La transformation du protoplaste est alors utilisée pour introduire le chromosome artificiel dans S. cerevisiae. La souche de levure qui est utilisée est un double mutant auxotrope, trp1-ura3-, qui est converti en trp1 + ura3 + par les deux marqueurs sur le chromosome artificiel. Les transformants sont donc sélectionnés par culture sur milieu minimal, sur lequel seules des cellules contenant un chromosome artificiel correctement construit sont capables de se développer. Toute cellule transformée avec un chromosome artificiel incorrect, contenant deux bras droits ou deux bras gauches plutôt qu’un de chacun, n’est pas capable de croître sur un milieu minimal car l’un des marqueurs est absent. La présence de l’ADN d’insertion dans le vecteur peut être vérifiée en testant l’inactivation par insertion de SUP4, qui est réalisée par un simple test de couleur: les colonies blanches sont des recombinants, les colonies rouges ne le sont pas.

Utilisations des  vecteurs YAC

Le stimulus initial dans la conception de chromosomes artificiels est venu de généticiens de levure qui voulait les utiliser pour étudier divers aspects de la structure et le comportement des chromosomes. Par exemple pour examiner la ségrégation des chromosomes lors de la méiose. Ces expériences ont établi que les chromosomes artificiels sont stables pendant la propagation dans des cellules de levure et ont soulevé la possibilité qu’ils pourraient être utilisés comme vecteurs pour des gènes qui sont trop longs pour être clones comme un seul fragment dans un vecteur d’E. coli. Plusieurs gènes de mammifères importants ont une longueur supérieure à 100 kb (par exemple, le gène de la mucoviscidose humaine est de 250 kb) qui est au-delà de la capacité de tous les systèmes de clonage d’E. Coli alors qu’ils sont dans la gamme d’un vecteur YAC. Les chromosomes artificiels de levure ont donc ouvert la voie à des études sur les fonctions et les modes d’expression de gènes qui avaient auparavant été intraitable à l’analyse par des techniques d’ADN recombinant. Une nouvelle dimension de ces expériences a été fournie par la découverte que, dans certaines circonstances, les YAC peuvent être propagés dans des cellules de mammifères, ce qui permet d’effectuer l’analyse fonctionnelle dans l’organisme dans lequel le gène réside normalement. Les chromosomes artificiels de levure sont également importants dans la production de banques de gènes. Rappelons qu’avec des fragments de 300 kb, la taille d’insert maximale pour le vecteur E. coli de capacité maximale, environ 30 000 clones sont nécessaires pour une banque de gènes humains. Cependant, les vecteurs YAC sont utilisés couramment pour cloner des fragments de 600 kb, et des types spéciaux sont capables de traiter l’ADN jusqu’à 1400 kb de longueur, ce dernier portant la taille d’une banque de gènes humains à seulement 6500 clones. Malheureusement, ces «méga-YAC» se heurtent à des problèmes de stabilité de l’insert, l’ADN cloné étant parfois réarrangé par recombinaison intramoléculaire. Néanmoins, les YAC ont été d’une immense valeur pour fournir de longues pièces d’ADN cloné pour une utilisation dans des projets de séquençage d’ADN à grande échelle.

Vecteurs pour d’autres levures et champignons :

Des vecteurs de clonage pour d’autres espèces de levures et de champignons sont nécessaires pour des études de base de la biologie moléculaire de ces organismes et pour étendre les utilisations possibles de levures et de champignons en biotechnologie. Les plasmides épisomiques basés sur le plasmide de 2 µm de S. cerevisiae sont capables de se répliquer dans quelques autres types de levures, mais la gamme des espèces n’est pas assez large pour que les 2 vecteurs µm soient de valeur générale. Dans tous les cas, les exigences de la biotechnologie sont mieux servies par des plasmides intégrateurs, équivalents à YIps, car ils fournissent des recombinants stables qui peuvent être cultivés pendant de longues périodes dans des bioréacteurs. Des vecteurs intégrateurs efficaces sont maintenant disponibles pour un certain nombre d’espèces, y compris des levures telles que Pichia pastoris et Kluveromyces lactis, et les champignons filamenteux tels que Aspergillus nidulans et Neurospora crassa.

Mettre l’ADN dans les cellules

Après que la séquence d’ADN à cloner a été joint au vecteur approprié, l’hybride doit être transféré dans des cellules pour l’amplification biologique. Le phénomène de la transformation des pneumocoques par l’ADN est connue depuis 1944. Une fois les propriétés génétiques souhaitables d’ E.coli ont été réalisées, elle aussi a été testée dans des expériences de transformation. Elles ont été infructueuses pendant de nombreuses années. Contre toute attente, un procédé de transformation d’E. coli a été découvert.

La Réintroduction d’une molécule d’ADN contenant un réplicon dans une cellule permet une amplification biologique de cette cellule à plus de 10 exposant 12. En un seul jour, une seule molécule peut être amplifiée à des quantités suffisantes pour des expériences physiques. La clé des protocoles de transformation initiale de E. coli a été le  traitement des cellules avec des ions calcium ou de rubidium pour les rendre compétentes pour l’absorption du plasmide ou de l’ADN du phage. Le terme transformation avec de l’ADN du phage qui donne alors une cellule infectée est une transfection, et ce terme est aussi  utilisé pour l’infection des cellules supérieurs avec l’ADN non viral. La levure peut être transfecté après un traitement qui comprend l’incubation, en présence d’ions lithium. Certains types de cellules de mammifère, des cellules L de souris, par exemple, peuvent être transfectés simplement en les arrosant avec un mélange de l’ADN et du phosphate de calcium cristaux. Ici, le mécanisme de transfection semble être l’absorption du complexe ADN-phosphate de calcium.

La Microinjection :

l’injection manuelle directe de petites quantités d’ADN dans les cellules a été très utile pour l’étude des fragments d’ADN clonés, car elle élimine la nécessité d’un réplicon ou un gène eucaryote sélectionnable. La microinjection dans les ovocytes de la grenouille Xenopus laevis a donné beaucoup d’information et la micro-injection dans des cellules de mammifère en culture est également possible. ADN injecté dans les cellules de Xenopus est transcrit pendant de nombreuses heures et traduit en quantités facilement détectables de protéine. En conséquence  un segment d’ADN peut être clones sur un plasmide tel que pBR322, manipulé in vitro et injectée dans les cellules pour examiner ses nouvelles propriétés biologiques. La microinjection est également possible dans un embryon de souris fertilisés. L’embryon peut alors être réimplanté à une souris pour se développer. Étant donné que les fragments d’ADN injecté se recombinent dans le chromosome, les souris seront transfectées par l’ADN. Pour que toutes les cellules de souris transfectée possèdent le même patrimoine génétique le fragment injecté doit recombiner dans une cellule de lignée germinale. Une telle souris est peu susceptible d’être génétiquement homogène car probablement les fragments similaires n’ont probablement pas intégrés dans les cellules somatiques. La progéniture d’une telle souris cependant peut être  génétiquement homogène, et celle-ci peut être étudiée  .

L’ Electroporation :

Une autre méthode générale pour incorporer de l’ADN dans les cellules est l’électroporation. Les cellules sont soumises à un champ électrique brève mais intense. Ce-ci crée de petits trous dans leurs membranes et pour une courte durée  les ADN présents dans la solution peuvent être absornéspar les cellules

Clonage à partir d’ARN :

Bien que l’ADN peut être extrait à partir des cellules et utilisé dans les étapes de clonage, parfois l’ARN est un meilleur choix de départ pour le clonage. Non seulement les séquences intermédiaires  peuvent être manquantes à partir d’ARNm, mais souvent l’ARNm extrait à partir de certains tissus est fortement enrichi pour les séquences de gènes spécifiques. Extraction de l’ARN à partir des cellules donne une prépondérance d’ ARN  ribosomal. L’ARN messager peut facilement être séparé de cet ARN ribosomal puisque la plupart des ARN messager de la plupart des organismes supérieurs contiennet une queue poly-A à l’extrémité 3 ‘. Cette queue peut être utilisé pour l’isolement en faisant passer une fraction brute de l’ARN cellulaire à travers une colonne de cellulose dans laquelle poly-dT a été lié. À des concentrations élevées en sel, les poly-dT qui sont reliées à la colonne et les queues poly-A des molécules qui sont  lieés aux ARN messagers de la colonne. Les molécules d’ARN ribosomique circulent librement à travers la colonne. Les ARN messagers sont sont libérés par abaissement de la concentration en sel de manière à affaiblir le poly-dT hybrides. Une telle étape de purification fournit souvent un plusieurs-centuple d’enrichissement pour l’ARN messager. L’effort nécessaire pour cloner le gène spécifique est souvent fortement réduite par l’utilisation de cette procédure en conjonction avec le choix d’un tissu particulier à un développement particulier. L’ARN simple brin obtenu par les étapes décrites ci-dessus ne peut pas être directement clonés. Ou bien l’ARN peut être converti en ADN par l’intermédiaire d’un brin complémentaire, l’ADNc ou l’ARN peut être utilisé pour faciliter l’identification d’un clone contenant la séquence d’ADN complémentaire. À générer une copie d’ADNc du messager poly-A contenant, plusieurs étapes sont effectuées . Tout d’abord, une amorce poly-dT est hybridée à l’ARN  messager et la transcriptase inverse est utilisé pour allonger l’apprêt et produire une copie de l’ADN. Cette enzyme, qui se trouve à l’intérieur du virus libre des particules de certains virus animaux, la synthèse de l’ADN en utilisant une matrice d’ARN. A ce stade, la séquence existe sous la forme d’un hybride ARN-ADN. Ceci se converti en un duplex d’ADN par incubation simultanée avec la RNAse H, qui coupe le brin d’ARN dans un duplex ARN-ADN et ADN polymérase  pol I supprime le reste de l’ARN par translation de coupure. Enfin, pour rendre les extrémités du duplex d’ADN parfaitement émoussé, l’ADN polymerase T4 pol I est ajouté. L’ADN double brin ainsi obtenu peut ensuite être cloné par des méthodes déjà discutées.

Hybridation de Plaque et de  Colonie pour l’identification de  Clone :

De nombreuses techniques ont été mises au point pour la détection des clones souhaités. Un des plus simples est la sélection génétique (Fig. 9.13). Le plus souvent cette simple avenue ne sont pas disponibles, mais on possède une séquence apparentée. Parfois, cette séquence apparentée provient d’un gène analogue au gène désiré, mais à partir d’un organisme différent. D’autres fois, des séquences d’acides aminés sont connues ou bien une approximation peut être faite quant à la la séquence des acides aminés. A partir de ces séquences, les séquences d’ADN peuvent être

Une variété de techniques de criblage direct existent pour la détection d’un gène cloné. Dans ces approches,le clonage de l’ADN étranger dans un vecteur lambda est pratique parce que le phage peut accueillir des fragments insérés de grande dimension et un grand nombre de phage lambda peuvent être criblés sur une seule boite de petri . La collection de phage candidat est appelé une banque lambda ou d’une bibliothèque.
Il est étalé sur des milliers de plaques par plaque. Ensuite, une copie de la réplique de
les plaques de phage est réalisé en appuyant sur un papier filtre sur la plaque. Après
le papier est enlevé, il est immergé dans une solution alcaline. Par ces étapes l’ADN
est dénaturé et fixé sur le papier. L’ARN marqué radioactivement puis
ou de l’ADN, appelé une sonde est hybridée à un ADN quelconque complémentaire
séquences en images de plaque sur le papier. La sonde contient la connue
séquence dérivée d’un clone isolé au préalable ou d’une séquence déduite
à partir des informations de séquence amino-acide. L’emplacement des zones
avec sonde liée sont ensuite déterminées par autoradiographie, et viable
phagique contenant l’insert désiré peut être isolé à partir du composé
la position sur la plaque originale. techniques analogues existent pour le dépistage
les colonies contenant les plasmides.
Marcher le long d’une Chromosome cloner un gène
Une autre méthode de clonage d’un gène désiré est la marche. Supposons qu’un hasard
clone isolé a été montré pour se situer à l’intérieur de plusieurs centaines
mille bases du segment d’ADN que nous souhaitons cloner. Bien sûr,
démontrant un tel fait est pas banal en soi. Dans le cas du fruit
mouche Drosophila melanogaster, cependant, la démonstration est simple.
Comme expliqué précédemment, les chromosomes polytènes dans les cellules de plusieurs
tissus de Drosophila possèdent des bandes caractéristiques qui servent de chromoso-
(une)
a fragments b c d clonées
une
b
c
(B)
ré
Composite carte de restriction du segment chromosomique
Restriction enzyme
des sites de clivage
La figure 9.14 (a) Un gel représentant des fragments d’ADN résultant d’une restriction
digestion enzymatique d’un ensemble de quatre séquences d’ADN se chevauchant partiellement. (B) Le
quatre ADN et leur composite.
284 génie génétique et l’ADN recombinant
repères mal. Par conséquent, l’ADN impliquée dans des réarrangements chromosomiques
ou suppressions peuvent être facilement observés. En outre ADN hautement radioactifs
provenant d’un segment clone de drosophile chromosomique peut être
hybridées in situ à drosophile chromosomes polytènes. La position à
que les fragments se hybride peuvent alors être déterminées par autoradiographie.
Par conséquent, la position chromosomique d’un fragment peut être clone
déterminé. Si elle se trouve à proximité d’un gène d’intérêt, la marche peut être dans l’ordre.
Une chromosomique à pied de cloner un gène spécifique commence par une restriction
carte de la pièce d’ADN clone. Le terminal de droite et de gauche-end
les fragments de restriction sont utilisées en tant que sondes d’une banque lambda. Plusieurs
Les clones sont choisis qui hybrident le fragment de droite et de ne pas
le fragment de gauche. Ensuite, les cartes de restriction de ces clones sont fabriqués
et encore les fragments de droite et de gauche sont utilisés pour trouver de nouveaux clones
qui hybrident uniquement aux fragments de droite (Fig. 9.14). successif
lambda transduction phage qui sont identifiés permis marche du
à droite, et lorsqu’une distance suffisante a été couverte, une hybridation in situ
permet de déterminer dans quelle direction sur l’ADN clone
correspond
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Vecteurs: la Sélection et réplication  autonome de l’ ADN :

Le clonage d’un morceau d’ADN exige qu’il soit répliqué quand il est remis dans les cellules. D’où l’ADN à cloner doit lui-même être une unité répliquante indépendante, un réplicon ou doit être joint à un réplicon. De plus, étant donné que l’efficacité de l’introduction de l’ADN dans des cellules est bien inférieur à 100%, les cellules qui ont absorbé l’ADN et on dit qu’elles ont été transformées, doivent être facilement identifiables. En effet, étant donné que seulement une bactérie cellule sur 105 est transformée, les sélections doivent généralement être incluses pour autoriser uniquement les cellules transformées de croître. Les vecteurs doivent remplir les deux conditions décrites ci-dessus, la réplication dans la cellule hôte et la sélection des cellules ayant reçu l’ADN transformant. Comme mentionné précédemment deux principaux types de vecteurs sont utilisés : des plasmides et des phages. Les plasmides contiennent des réplicons bactériens qui peuvent coexister avec l’ADN cellulaire normal et au moins un gène sélectionnable. Habituellement c’est un gène conférant une résistance à une antibiotique. Les phages contiennent bien sûr des gènes pour la réplication de leur ADN. Comme l’ADN emballé dans une enveloppe de phage peut pénétrer dans les cellules de manière efficace des gènes sélectionnables sur les phages habituellement ne sont pas nécessaires.

Vecteur plasmidique :

La plupart des plasmides sont de petits cercles qui contiennent les éléments nécessaires pour la réplication de l’ADN, un ou deux gènes de résistance aux médicaments et une région d’ADN dans laquelle l’ADN étranger peut être inséré sans endommager les fonctions  essentielles du plasmide.

 

Un plasmide largement utilisé, pBR322, porte des gènes codant pour la résistance à la tetracycline et β-lactamase celle-ci confère une résistance à la pénicilline et aux  analogues apparentés en clivant les médicaments dans le cycle lactame, ce qui les rend biologiquement inactifs. Des gènes conférant une résistance au chloramphénicol, à la tétracycline et kanamycine sont d’autres marqueurs de résistance aux médicaments couramment sélectionnables portés sur des plasmides.

Un élément utile à avoir sur les plasmides est une origine de réplication de l’ADN à partir d’un phage simple brin. Quand une telle origine est activée par l’infection de tel phage, la cellule synthétise des quantités importantes d’un seul brin de l’ADN du plasmide. Ceci facilite le séquençage de l’ADN. Dans une expérience typique de  clonage  un plasmide est coupé dans une région non essentielle par une enzyme de restriction  par exemple EcoRI et  l’ADN monocaténaire  étranger, coupé par EcoRI,  est ajouté et  les extrémités hybrides sont soudées ensemble. Seule une petite fraction des plasmides, soumis à ce traitement contiendra  l’ADN inséré. La plupart auront recircularisé sans insertion d’ADN étranger. Comment les bactéries  transformées c.à.d ceux dont les plasmides contiennent l’ADN  inséré peuvent être distinguées des autres (ceux dont le plasmide reste  sans ADN inséré)? Bien entendu dans certaines conditions une sélection génétique peut être utilisée pour activer uniquement la croissance  des éléments transformés avec le fragment souhaité d’ADN inséré. Le plus souvent cela n’est pas possible et il devient nécessaire d’identifier des candidats qui contiennent l’ADN inséré.Une méthode pour identifier des candidats repose sur l’inactivation par l’ insertion d’un gène de résistance aux médicaments.

Par exemple, dans la résistance à l’ampicilline, le gène de la résistance sur pBR322 possède un seul site de clivage du plasmide par l’enzyme de restriction PstI. Heureusement le clivage par PstI  génère des extrémités collantes et l’ADN peuvent être facilement soudées  à ce niveau, après quoi il désactive le gène de la résistance à l’ampicilline. Le gène de résistance à la tétracycline sur le plasmide demeure intact et peut être utilisé pour la sélection des cellules transformées par le plasmide recombinant. Les colonies résultantes peuvent être testées en repérant sur une paire de plaques, l’une contenant de l’ampicilline, et l’autre sans ampicilline. Seul les mutants  ampicilline sensibles, tétracycline-résistants  vont contenir l’ADN étranger dans le plasmide alors que les ampicilline résistantess possèdent des plasmides re-circularisés sans insertion de l’ADN étranger.

Une autre façon pour vérifier l’insertion d’ADN étranger, utilise le gène de ß-galactosidase. L’insertion d’ADN étranger dans le gène  inactive l’enzyme qui peut être détectée en mettant les cellules transformées sur un milieu qui sélectionne la présence du plasmide et contient également des substrats de β-galactosidase qui produisent des colorants  lorsqu’il hydrolyse ces substrats.
Un plasmide serait lourd s’il contenait la totalité des 3000 paires de bases du gène β galactosidase. Par conséquent seule une extrémité N-terminale  du gène est placé sur le plasmide. Le reste de l’enzyme est codée par un segment inséré dans le chromosome des cellules hôtes. Les deux parties du gène synthétisent des domaines qui se lient entre eux pour donner l’enzyme actif. Ce phénomène inhabituel est appelé alpha-complémentation.

 

 

Des vecteurs de clonage sont conçus pour l’insertion d’ ADN étranger dans la partie N-terminale de la β-galactosidase. Une technique simple peut réduire considérablement la re-circularisation des molécules du vecteur sans insertion de l’ADN étranger. Si l’ADN du vecteur est traité par une phosphatase après coupure par l’enzyme de restriction, la re-circularisation devient impossible parce que l’extrémité 5′-PO4  requise pour  l’ ADN ligase est absente. L’ADN étranger, cependant, contient une extrémité 5′-PO4  et par conséquent  deux des quatre fragments d’ADN  encadrant un fragment d’ADN étranger peuvent être soudés. Cet ADN est actif dans la transformation parce que les cellules réparent le pseudo restant à chaque extrémité du fragment inséré. Les vecteurs de clonage plasmides ou phages peuvent contenir un court tronçon de l’ADN contenant des sites de coupure unique pour plusieurs enzymes de restriction. Ces régions à liaisons multiples  (polylinker) permettent le clivage par deux enzymes de sorte que les extrémités collantes résultantes ne sont pas auto-complémentaire. Donc le vecteur ne peut pas se re-circularisé et être resoudé sur lui-même mais quand un fragment d’ADN contenant les extrémités nécessaires et complémentaires  aux extrémités du plasmide existe alors il peut le faire. Une génie génétique efficace nécessite que l’ADN plasmidique soit obtenu en grandes quantités. Certains plasmides maintiennent seulement trois ou quatre copies par cellule, tandis que d’autres plasmides ont 25 à 50 copies cellulaires. La plupart des plasmides ayant un nombre importants de copies peuvent être amplifiée du fait que le plasmide continue de se répliquer après que la synthèse protéique et la synthèse de l’ADN cellulaire ont cessé en raison d’une densité cellulaire  élevée ou  la présence d’inhibiteurs de la synthèse des protéines. Après amplification, une cellule contenant un tel plasmide peut contenir jusqu’à 3000 copies de plasmide.

 

La nature n’a pas livré des vecteurs plasmidiques prêt pour le génie génétique.Les vecteurs plasmidiques les plus utiles ont été eux-mêmes construits par génie génétique. Les matières de départ sont les plasmides R, ce sont des plasmides ou des éléments d’ADN à réplication autonome qui portent un ou plusieurs gènes de résistance aux médicaments. Les plasmides R sont la cause de graves problèmes médicaux, car diverses bactéries peuvent acquérir des plasmides R et ainsi devenir résistant aux médicaments normalement  utilisés pour le traitement des infections . La conversion d’un plasmide R en un vecteur  utile nécessite l’élimination de l’ADN étranger et l’élimination des multiples sites de clivage par des enzymes de restriction. Afin que l’ADN étranger puisse être cloné dans le plasmide, le plasmide doit posséder un seul site de  clivage pour au moins une enzyme de restriction, et cela devrait être dans une région  non essentielle. Dans la construction des vecteurs de clonage, des plasmides ont été digérés avec diverses enzymes de restriction. Le mélange résultant de fragments d’ADN a été hybridés ensemble par l’intermédiaire des extrémités auto-complémentaires, puis collées pour produire de nombreuses combinaisons de fragments possibles . Ces ADN ont été transférés  dans des cellules. Seuls les nouveaux plasmides contenant au moins les segments d’ADN nécessaires à la réplication et à la  résistance aux  médicaments ont survécu et ont donné des colonies. Les plasmides souhaitables contenant uniquement  les sites de clivage uniques pour des enzymes de restriction peuvent être identifiés par l’amplification et la purification de l’ADN suivie par des digestions test avec des enzymes de restriction suivi d’électrophorèse pour caractériser les Produits de  la digestion. Le plasmide pBR322 possède une seule site de clivage  pour plus de 20 enzymes de restriction. Parmi les plus communément utilisés sont  Bam HI, Eco RI, Hind III, PstI, PvuII et Sali.

Un vecteur phagique pour les bactéries :

des vecteurs de phage et des vecteurs dérivés de phages sont utiles pour trois raisons:

-les phages peuvent transporter de plus  grands fragments d’ADN insérés que des plasmides. Donc beaucoup moins de candidats transformés doivent être examinés pour trouver un clone désiré.

-L’efficacité d’infecter les cellules par l’ADN des phages reconditionnés est considérablement plus grande que l’efficacité de la transformation avec L’ADN de plasmide dans les cellules. Ceci est un facteur important quand un clone rare est recherché.

-Enfin, le phage lambda permet un procédé commode pour le criblage pour détecter le clone porteur du gène désiré. Cependant une fois qu’un segment désiré d’ADN a été cloné dans un phage la commodité de manipuler des plasmides, en partie en raison de leur petite taille, dicte que le segment soit sous-cloné dans un plasmide.

Vecteur de clonage basé sur le bactériophage M13 :

L’exigence la plus essentielle pour tout vecteur de clonage est qu’il ait un moyen de se répliquer dans la cellule hôte. Pour les vecteurs plasmidiques, cette exigence est facile à satisfaire, car des séquences d’ADN relativement courtes sont capables d’agir comme origines de réplication plasmidiques, et la plupart, sinon la totalité, des enzymes nécessaires à la réplication sont fournies par la cellule hôte. Des manipulations élaborées, telles que celles qui ont abouti à pBR322, sont donc possibles tant que la construction finale a une origine de réplication fonctionnelle et intacte. Avec des bactériophages tels que M13 et e, la situation en matière de réplication est plus complexe. Les molécules d’ADN phagique portent généralement plusieurs gènes essentiels à la réplication, y compris des gènes codant pour des composants de la couche protéique du phage et des enzymes réplicatives spécifiques de l’ADN phagique. La modification ou la suppression de l’un de ces gènes altèrent ou détruisent la capacité de réplication de la molécule résultante. Il y a donc beaucoup moins de liberté pour modifier les molécules d’ADN phagique, et généralement les vecteurs de clonage de phages ne sont que légèrement différents de la molécule parente.

Les problèmes de construction d’un vecteur de phages sont illustrés en considérant M13. Le génome M13 normal a une longueur de 6,4 kb, mais la plus grande partie de ce génome est occupée par dix gènes étroitement liés, chacun étant essentiel à la réplication du phage. Il n’y a qu’une seule séquence intergénique de 507 nucléotides dans laquelle un nouvel ADN pourrait être inséré sans perturber l’un de ces gènes, et cette région comprend l’origine de réplication qui doit elle-même rester intacte. Clairement, il n’y a qu’une possibilité limitée de modifier le génome M13.

La première étape de construction d’un vecteur M13 consistait à introduire le gène lacZ ‘dans la séquence intergénique. Cela a donné M13mp1, qui forme des plaques bleues sur de l’agar X-gal.

M13mp1 ne possède pas de sites de restriction uniques dans le gène lacZ ‘. Cependant, il contient l’hexanucléotide GGATTC près du début du gène. Un seul changement de nucléotide rendrait ce GAATTC, qui est un site EcoRI.

Cette altération a été réalisée en utilisant la mutagenèse in vitro, résultant en M13mp2

M13mp2 a un gène lacZ′ légèrement modifié (le sixième codon spécifie maintenant l’asparagine à la place de l’acide aspartique), mais l’enzyme β-galactosidase produite par les cellules infectées par M13mp2 est encore parfaitement fonctionnelle. L’étape suivante dans le développement des vecteurs M13 consistait à introduire des sites de restriction supplémentaires dans le gène lacZ’. Ceci a été réalisé en synthétisant dans le tube à essai un oligonucléotide court, appelé polylinker, qui consiste en une série de sites de restriction et a des extrémités collantes EcoRI.

Ce linker multisite a été inséré dans le site EcoRI de M13mp2, pour donner M13mp7, un vecteur plus complexe avec quatre sites de clonage possibles (EcoRI, BamHI, Sali et PstI). Le polylinker est conçu pour ne pas perturber totalement le gène lacZ’: un cadre de lecture est maintenu dans tout le polylinker, et une enzyme β-galactosidase fonctionnelle bien que modifiée est encore produite. Les vecteurs M13 les plus sophistiqués ont des polylinkers plus complexes insérés dans le gène lacZ’. Un exemple est M13mp8, qui a la même série de sites de restriction que le plasmide pUC8 . Comme avec le vecteur plasmidique, un avantage de M13mp8 est sa capacité à prendre des fragments d’ADN avec deux extrémités cohésives différentes.

Phagemides (vecteurs hybrides formés de plasmides et M13) :

Bien que les vecteurs M13 soient très utiles pour la production de versions monocaténaires de gènes clonés, ils souffrent d’un inconvénient. Il y a une limite à la taille du fragment  d’ADN qui peut être cloné avec un vecteur M13, avec 1500 pb comme la capacité maximale, bien que des fragments jusqu’à 3 kb ont parfois été cloné. Pour contourner ce problème, un certain nombre de vecteurs hybrides (« phagemides ») ont été développé en combinant une partie du génome M13 avec l’ADN plasmidique. Un exemple est fourni par pEMBL8, qui a été faite en transférant dans pUC8 un fragment de 1300 pb du génome M13.

Ce morceau d’ADN M13 contient la séquence signal reconnue par les enzymes qui convertissent le double brin normal de M13 en ADN simple brin avant la sécrétion de nouvelles particules phagiques. Cette  séquence de signaux est toujours fonctionnelle même si elle est détachée du reste du génome de M13, les molécules pEMBL8 sont également converties en ADN simple brin et sécrété comme particules phagiques défectueuses.

 

Tout ce qui est nécessaire, c’est que les cellules de E. coli utilisées en tant qu’hôtes pour une expérience de clonage pEMBL8 sont ensuite infectés avec M13 normal à agir comme un phage auxiliaire, fournissant les enzymes réplicatives nécessaires et les protéines de l’enveloppe du phage. pEMBL8, dérivé de pUC8, a les sites de clonage de polylinker dans le lacZ ‘ gène, de sorte que les plaques recombinantes peuvent être identifiées de manière standard sur de l’agar contenant X-gal. Avec pEMBL8, versions monocaténaires de fragments d’ADN clonés jusqu’à 10 kb en longueur peut être obtenue, en étendant considérablement la portée du système de clonage M13.

Vecteurs de clonage basés sur bactériophage λ :

Deux problèmes devaient être résolus avant que les vecteurs de clonage basés sur λ puissent être développés:
l) La molécule d’ADN de λ peut être augmentée seulement d’environ 5%, ce qui représente l’addition de seulement 3 kb de nouveaux ADN. Si la taille totale de la molécule est supérieure à 52 kb, alors elle ne pourra pas être empaquetée dans la structure de la tête e et les particules de phages infectieuses ne sont pas formées. Ceci limite sévèrement la taille d’un fragment d’ADN qui peut être inséré dans un vecteur λ non modifié.
2) Le génome λ est si grand qu’il a plus d’une séquence de reconnaissance pour pratiquement chaque endonucléase de restriction. La restriction ne peut pas être utilisée pour cliver la molécule λ normale de manière à permettre l’insertion d’un nouvel ADN, car la molécule serait coupée en plusieurs petits fragments qui seraient très peu susceptibles de reformer un génome λ viable lors de la religation. Au vu de ces difficultés, il est peut-être surprenant qu’une grande variété de vecteurs de clonage λ aient été développés, leur utilisation principale étant de cloner de gros morceaux d’ADN de 5 à 25 kb, beaucoup trop gros pour être manipulés par des vecteurs plasmidiques ou M13.

Des segments du génome λ peuvent être supprimés sans compromettre sa viabilité :

La voie à suivre pour le développement de vecteurs de clonage a été fournie par la découverte qu’un grand segment dans la région centrale de la molécule d’ADN peut être éliminé sans affecter la capacité du phage à infecter des cellules de E. coli. L’élimination de tout ou partie de cette région non essentielle,  jusqu’à 15 kb. Cela signifie que jusqu’à 18 kb de nouvel ADN peuvent maintenant être ajoutés avant que le seuil de l’emballage ne soit atteint . Cette région « non-essentielle » contient en effet la plupart des gènes impliqués dans l’intégration et l’excision du prophage λ du chromosome de E. coli. Un génome de λ  modifié par suppression est donc non lysogène et ne peut suivre que le cycle d’infection lytique. Ceci est en soi souhaitable pour un vecteur de clonage car cela signifie qu’une induction n’est pas nécessaire avant la formation de plaques .

 

La sélection naturelle peut être utilisée pour isoler des λ modifiés dépourvus de certains sites de restriction :

Natural selection can be used to isolate modified * that lack certain restriction sites Even a deleted e genome, with the non-essential region removed, has multiple recognition sites for most restriction endonucleases. This is a problem that is often encountered when a new vector is being developed. If just one or two sites need to be removed, then the technique of in vitro mutagenesis (p. 200) can be used. For example, an EcoRI site, GAATTC, could be changed to GGATTC, which is not recognized by the enzyme. However, in vitro mutagenesis was in its infancy when the first e vectors were under development, and even today would not be an efficient means of changing more than a few sites in a single molecule. Instead, natural selection was used to provide strains of e that lack the unwanted restriction sites. Natural selection can be brought into play by using as a host an E. coli strain that produces EcoRI. Most e DNA molecules that invade the cell are destroyed
by this restriction endonuclease, but a few survive and produce plaques. These are mutant phages, from which one or more EcoRI sites have been lost spontaneously (Figure 6.11). Several cycles of infection will eventually result in e molecules that lack all or most of the EcoRI sites.

6.3.3 Insertion and replacement vectors
Once the problems posed by packaging constraints and by the multiple restriction sites had been solved, the way was open for the development of different types of λ-based cloning vectors. The first two classes of vector to be produced were λ insertion and λ replacement (or substitution) vectors.

λ Insertion vectors
With an insertion vector (Figure 6.12a), a large segment of the non-essential region has
been deleted, and the two arms ligated together. An insertion vector possesses at least
one unique restriction site into which new DNA can be inserted. The size of the DNA
fragment that an individual vector can carry depends, of course, on the extent to which
the non-essential region has been deleted. Two popular insertion vectors are:
l Egt10 (Figure 6.12b), which can carry up to 8 kb of new DNA, inserted into a
unique EcoRI site located in the cI gene. Insertional inactivation of this gene means
that recombinants are distinguished as clear rather than turbid plaques (p. 83).

λ replacement vectors.

A e replacement vector has two recognition sites for the restriction endonuclease used
for cloning. These sites flank a segment of DNA that is replaced by the DNA to be
cloned (Figure 6.13a). Often the replaceable fragment (or “stuffer fragment” in cloning
jargon) carries additional restriction sites that can be used to cut it up into small pieces,
so that its own re-insertion during a cloning experiment is very unlikely. Replacement
vectors are generally designed to carry larger pieces of DNA than insertion vectors can
handle. Recombinant selection is often on the basis of size, with non-recombinant vectors
being too small to be packaged into e phage heads (p. 84).
An example of a replacement vectors is:
l EEMBL4 (Figure 6.13b) can carry up to 20 kb of inserted DNA by replacing a
segment flanked by pairs of EcoRI, BamHI, and SalI sites. Any of these three
restriction endonucleases can be used to remove the stuffer fragment, so DNA
fragments with a variety of sticky ends can be cloned. Recombinant selection with
eEMBL4 can be on the basis of size, or can utilize the Spi phenotype (p. 83).
6.3.4 Cloning experiments with * insertion or replacement
vectors
A cloning experiment with a e vector can proceed along the same lines as with a plasmid
vector—the e molecules are restricted, new DNA is added, the mixture is ligated,
and the resulting molecules used to transfect a competent E. coli host (Figure 6.14a).
This type of experiment requires that the vector be in its circular form, with the cos
sites hydrogen bonded to each other.
Although satisfactory for many purposes, a procedure based on transfection is not
particularly efficient. A greater number of recombinants will be obtained if one or two
refinements are introduced. The first is to use the linear form of the vector. When the
linear form of the vector is digested with the relevant restriction endonuclease, the
left and right arms are released as separate fragments. A recombinant molecule can
100 Part I The Basic Principles of Gene Cloning and DNA Analysis
λ arms
EcoRI EcoRI
EcoRI
EcoRI
New DNA
cos cos
cos
cos cos
Catenane cos
EcoRI EcoRI
EcoRI
EcoRI
EcoRI, ligate
(a) Cloning with circular λ DNA
(b) Cloning with linear λ DNA
λ insertion factor
– circular form
cos cos
Transfect
E. coli
Infect E. coli
in vitro
packaging mix
Recombinant
molecule
Recombinant λ
New DNA
Ligate
Figure 6.14
Different strategies for cloning with a λ vector. (a) Using the circular form of λ as a plasmid. (b) Using left and right arms
of the λ genome, plus in vitro packaging, to achieve a greater number of recombinant plaques.
be constructed by mixing together the DNA to be cloned with the vector arms
(Figure 6.14b). Ligation results in several molecular arrangements, including catenanes
comprising left arm–DNA–right arm repeated many times (Figure 6.14b). If the inserted
DNA is the correct size, then the cos sites that separate these structures will be the right
distance apart for in vitro packaging (p. 81). Recombinant phage are therefore
produced in the test tube and can be used to infect an E. coli culture. This strategy, in particular
the use of in vitro packaging, results in a large number of recombinant plaques.
6.3.5 Long DNA fragments can be cloned using a cosmid
The final and most sophisticated type of e-based vector is the cosmid. Cosmids are
hybrids between a phage DNA molecule and a bacterial plasmid, and their design
centers on the fact that the enzymes that package the e DNA molecule into the phage
protein coat need only the cos sites in order to function (p. 21). The in vitro packaging
reaction works not only with e genomes, but also with any molecule that carries cos sites
separated by 37–52 kb of DNA.
A cosmid is basically a plasmid that carries a cos site (Figure 6.15a). It also needs a
selectable marker, such as the ampicillin resistance gene, and a plasmid origin of replication,
as cosmids lack all the e genes and so do not produce plaques. Instead colonies are
formed on selective media, just as with a plasmid vector.
Chapter 6 Cloning Vectors for E. coli 101
BamHI
ori
cos
BamHI
cos
Circular
pJB8
Restrict with
BamHI
BamHI BamHI
cos
cos cos
Linear pJB8 BamHI
BamHI BamHI BamHI
BamHI
New DNA
New
DNA
Ligate
In vitro package
Recombinant
cosmid DNA
Colonies containing circular
recombinant pJB8 molecules
Ampicillin medium
Infect E. coli
(a) A typical cosmid
(b) Cloning with pJB8
pJB8
5.4 kb
λ DNA
Catenane
λ particles
ampR
ampR
ampR
ampR
Figure 6.15
A typical cosmid and the way it is used to clone long fragments of DNA.
A cloning experiment with a cosmid is carried out as follows (Figure 6.15b). The
cosmid is opened at its unique restriction site and new DNA fragments inserted. These
fragments are usually produced by partial digestion with a restriction endonuclease, as
total digestion almost invariably results in fragments that are too small to be cloned with
a cosmid. Ligation is carried out so that catenanes are formed. Providing the inserted
DNA is the right size, in vitro packaging cleaves the cos sites and places the recombinant
cosmids in mature phage particles. These e phage are then used to infect an E. coli
culture, though of course plaques are not formed. Instead, infected cells are plated onto
a selective medium and antibiotic-resistant colonies are grown. All colonies are recombinants,
as non-recombinant linear cosmids are too small to be packaged into e heads.
6.4 8 and other high-capacity vectors enable
genomic libraries to be constructed
The main use of all e-based vectors is to clone DNA fragments that are too long to be
handled by plasmid or M13 vectors. A replacement vector, such as eEMBL4, can carry
up to 20 kb of new DNA, and some cosmids can manage fragments up to 40 kb. This
102 Part I The Basic Principles of Gene Cloning and DNA Analysis
Table 6.1
Number of clones needed for genomic libraries of a variety of organisms.
NUMBER OF CLONES*
SPECIES GENOME SIZE (bp) 17 kb FRAGMENTS† 35 kb FRAGMENTS‡
E. coli 4.6 × 106 820 410
Saccharomyces cerevisiae 1.8 × 107 3225 1500
Drosophila melanogaster 1.2 × 108 21,500 10,000
Rice 5.7 × 108 100,000 49,000
Human 3.2 × 109 564,000 274,000
Frog 2.3 × 1010 4,053,000 1,969,000
*Calculated for a probability ( p) of 95% that any particular gene will be present in the library.
†Fragments suitable for a replacement vector such as yEMBL4.
‡Fragments suitable for a cosmid.
compares with a maximum insert size of about 8 kb for most plasmids and less than 3 kb
for M13 vectors.
The ability to clone such long DNA fragments means that genomic libraries can be
generated. A genomic library is a set of recombinant clones that contains all of the DNA
present in an individual organism. An E. coli genomic library, for example, contains all
the E. coli genes, so any desired gene can be withdrawn from the library and studied.
Genomic libraries can be retained for many years, and propagated so that copies can be
sent from one research group to another.
The big question is how many clones are needed for a genomic library? The answer
can be calculated with the formula:
N =
where N is the number of clones that are required, p is probability that any given gene
will be present, a is the average size of the DNA fragments inserted into the vector, and
b is the total size of the genome.
Table 6.1 shows the number of clones needed for genomic libraries of a variety of
organisms, constructed using a e replacement vector or a cosmid. For humans and other
mammals, several hundred thousand clones are required. It is by no means impossible
to obtain several hundred thousand clones, and the methods used to identify a clone
carrying a desired gene (Chapter 8) can be adapted to handle such large numbers, so
genomic libraries of these sizes are by no means unreasonable. However, ways of reducing
the number of clones needed for mammalian genomic libraries are continually being
sought.
One solution is to develop new cloning vectors able to handle longer DNA inserts.
The most popular of these vectors are bacterial artificial chromosomes (BACs), which
are based on the F plasmid (p. 16). The F plasmid is relatively large and vectors derived
from it have a higher capacity than normal plasmid vectors. BACs can handle DNA
inserts up to 300 kb in size, reducing the size of the human genomic library to just
30,000 clones. Other high-capacity vectors have been constructed from bacteriophage
P1, which has the advantage over e of being able to squeeze 110 kb of DNA into its
ln(1 − p)
ln
A
1 − aD
C bF
Chapter 6 Cloning Vectors for E. coli 103
FURTHER READING
Further reading
Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Green, P.J. et al. (1977) Construction and characterization of
new cloning vectors. II. A multipurpose cloning system. Gene, 2, 95–113. [pBR322.]
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and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene,
33, 103–119.
capsid structure. Cosmid-type vectors based on P1 have been designed and used to clone
DNA fragments ranging in size from 75 to 100 kb. Vectors that combine the features
of P1 vectors and BACs, called P1-derived artificial chromosomes (PACs), also have a
capacity of up to 300 kb.
6.5 Vectors for other bacteria
Cloning vectors have also been developed for several other species of bacteria, including
Streptomyces, Bacillus, and Pseudomonas. Some of these vectors are based on
plasmids specific to the host organism, and some on broad host range plasmids able to
replicate in a variety of bacterial hosts. A few are derived from bacteriophages specific
to these organisms. Antibiotic resistance genes are generally used as the selectable
markers. Most of these vectors are very similar to E. coli vectors in terms of their general
purposes and uses.

 

Le phage Lambda était un choix idéal pour un vecteur de phage, car il était bien compris et facile à travailler. Plus important encore, le phage contient une région non essentielle interne vaste flanquée par des sites de clivage Eco RI. Par conséquent, cette région non essentielle peut être enlevée et l’ADN étranger inséré. Avant de l’ADN lambda coupé par Eco RI peut être utilisé pour le clonage, il était nécessaire d’éliminer les sites de clivage supplémentaires qui sont situés à dans les régions essentielles du génome lambda. Tout d’abord, un phage lambda hybride a été construit par recombinaison génétique in vivo. Cela manquait trois sites de clivage EcoRI à 0,438, 0,538 et 0,654 dans la région non essentielle mais a conservé les deux sites dans les régions essentielles. Ensuite, les deux autres les sites de clivage Eco RI ont été éliminés par mutation et sélection. Dans la sélection du phage ont été cyclée entre hôtes manquant et contenant les systèmes de modification de restriction EcoRI. Tous les phages avec le clivage des sites mutés de manière à être nonrecognizable par le système Eco RI aurait une plus grande probabilité d’échapper aux enzymes de restriction sur la croissance dans le second hôte. Après 10 à 20 cycles de cette sélection régime, Davis a trouvé un phage qui avait perdu l’un des deux sites R1, et après un 9 à 10 cycles supplémentaires, il a trouvé un mutant qui avait perdu la autre site. Ce phage mutant a ensuite été transformé en un vecteur de clonage utile par recombinaison avec le type sauvage lambda pour restaurer les trois EcoRI des sites de clivage situé dans la partie centrale du génome. L’ADN isolé des particules de phage lambda est linéaire et il peut être clivé par EcoRI pour donner les fragments centraux plus petits et les plus grands des bras gauche et droit. Les fragments d’ADN clonés pour être clivé par EcoRI peut ensuite être hybridé ensemble et ligaturé à droite purifié et bras gauche. Ce Soit l’ADN peut être utilisé tel quel pour transfecter des cellules rendues compétentes pour son prise ou il peut être encapsidé in vitro dans des têtes de phage et utilisé pour infecter
A J 2
Essentiel
b cI rouge int nin QSR
Essentiel
0,438 0,538 0,654 0,808 0,927
278 génie génétique et l’ADN recombinant
cellules. L’efficacité, par molécule de l’ADN, de l’emballage et l’infection est
beaucoup plus élevé que la transfection avec de l’ADN nu. Par conséquent, l’emballage est
utilisé lorsque le fragment à cloner est présent en quelques exemplaires seulement.
Vecteurs pour cellules supérieures
Le clonage de l’ADN dans des cellules plus élevées pose les mêmes problèmes que le clonage dans
bactéries. Les vecteurs doivent permettre simplement la purification de quantités considérables
de l’ADN, doit permettre la sélection des cellules transformées, et doit posséder
l’espace pour l’ADN inséré. Les vecteurs navettes, qui ont été largement
utilisé pour le clonage dans la levure, sont une solution élégante à ces exigences. Dans
plus de contenir les éléments de clonage de plasmide bactérien normal,
ils contiennent un réplicon de levure et un marqueur génétique sélectionnable dans la levure
(Fig. 9.10). En conséquence, de grandes quantités des vecteurs peuvent être obtenus
par croissance dans E. coli et ensuite transformée en levure. La capacité à
navette entre les bactéries et les levures permet d’économiser beaucoup de temps et de dépenses en
expériences de génie génétique.
Deux types d’origines de réplication de levure peuvent être utilisés dans la navette de levure
vecteurs. La première est une origine de réplication de l’ADN chromosomique de levure, également connue
comme un élément ARS. L’autre est l’origine 2 μ à partir des cercles. Ces
sont des éléments plasmidiques-like avec fonction inconnue qui se trouvent dans
Levure. Ils sont un peu plus stables que les vecteurs ARS. Nutritional
des marqueurs tels que l’uracile, l’histidine, la leucine et la biosynthèse du tryptophane
ont été utilisés comme gènes de sélection appropriée dans le auxotrophe
Levure.
Les virus constituent une base pour de nombreux vecteurs utiles dans plante supérieure et
des cellules animales. Par exemple, l’un des vecteurs les plus simples pour les mammifères
des cellules est le SV4O du virus simien. Il permet un grand nombre des mêmes clonage
que les opérations du phage lambda.
La terminologie utilisée avec des cellules de mammifères peut être déroutant.
« Transformation » peut signifier que les cellules ont reçu un plasmide. Ça peut
signifient également que les cellules ont perdu leur inhibition de contact. Dans cet état,
ils continuent de croître au-delà du stade de la monocouche de cellules confluentes à laquelle
ADN de levure
l’origine de replication
ampicilline
la résistance
tétracycline
la résistance
Origine de
Réplication de l’ADN
YRP17
TRP
E. coli
URA
ADN de levure
ADN de levure
Figure 9.10 La structure de
un vecteur pour la navette entre
E. coli et la levure. Il contient
les gènes qui permettent la réplication de l’ADN
et la sélection à la fois
organismes.
Vecteurs pour cellules supérieures 279
des cellules normales de mammifères cessent croissance. Transformation de la désinhibée
état de croissance peut résulter d’une infection par un virus de la tumeur comme causant
SV4O ou elle peut être le résultat d’une mutation du génome. Bien que la perte de
l’inhibition de contact pourrait être utile pour identifier les cellules qui ont incorporé
les hybrides SV4O ADN ou SV4O, cette propriété est d’une utilité limitée.
D’autres marqueurs génétiques sélectionnables convenables pour des cellules de mammifères sont
Obligatoire.
Un gène utile pour les sélections dans les cellules de mammifères a été le
le gène de la thymidine kinase, car les cellules TK + peuvent être sélectionnées en cultivant
elles dans un milieu contenant de l’hypoxanthine, de l’aminoptérine et de la thymidine.
A l’inverse, les cellules TK- peuvent être sélectionnées en les cultivant dans un milieu
contenant de la bromodésoxyuridine (Fig. 9.11). En outre, les virologues
ont découvert précédemment que les codes de virus de l’herpès simplex de son
propre thymidine kinase. Par conséquent, le génome viral peut être utilisé en tant que
source concentrée du gène sous une forme exprimable pour le clonage initial
expériences.
Bien que le gène de la thymidine kinase a été utile pour la sélection de cellules
qui ont absorbé l’ADN étranger, un gène de sélection qui ne nécessite pas
l’isolement préalable d’une thymidine kinase mutant négatif dans chaque cellule
ligne serait également utile. E. coli enzyme xanthine-guanine
Hypoxanthine + Aminopterin + thymidine
Précurseurs IMP XMP GMP
xanthine
(Voie faible
les cellules de mammifères)
xanthine phosphoribosyl
transférase
GTP
AMP
thymidine
kinase
Aminopterin
dUMP dTMP (BrdU-MP, toxiques)
mycophénolique
acide
Thymidine (BrdU)
hypoxanthine
Brdu TK
TK +
–
Sélectionner
Figure 9.11 Les voies métaboliques impliquées avec quelques gènes sélectionnables dans
les cellules de mammifères. IMP-inosine monophosphate, monophosphate XMP-xanthine,
GMP-guanosine monophosphate, duMP-désoxyuridine monophosphate,
dTMP-désoxythymidine monophosphate, Brdu-bromodésoxyuridine, Brdu-MP,
monophosphate bromodésoxyuridine. blocs aminoptérine tétrahydrofolate réductase,
qui est nécessaire pour la synthèse de l’IMP et dTMP et mycophénolique
l’acide bloque la synthèse de XMP.
280 génie génétique et l’ADN recombinant
gène transférase phosphoribosyl semble répondre à ces exigences.
Le produit protéique des fonctions de gènes dans des cellules de mammifères et
permet la croissance sélective des cellules non mutant qui contiennent l’enzyme
(Fig. 9.11). Le milieu de croissance requis contient la xanthine, l’hypoxanthine,
aminoptérine, et de l’acide mycophénolique. D’autres gènes dominants
utile pour la sélection des cellules transformées sont des mutants de dihydrofolate
réductase qui est résistante au methotrexate, un inhibiteur puissant de la
Enzyme de type sauvage, et la kanamycine-néomycine phosphotransférase. le
celle-ci est une enzyme dérivée d’un transposon bactérien et confère
résistance aux bactéries, des levures, des plantes et des cellules de mammifères à un composé
appelé G418. Bien entendu, pour une expression appropriée dans les cellules supérieures, la
gène doit être relié à une unité de transcription appropriée et doivent
contenir les signaux d’initiation et de polyadénylation traduction requis.
mettre l’ADN

Définition :

Les termes du génie génétique et l’ADN recombinant se réfèrent à des techniques dans lesquelles l’ADN peut être coupé, rejoint, sa séquence déterminée ou la séquence d’un segment modifié en fonction de l’utilisation prévue. Par exemple, un fragment d’ADN peut être isolé d’un organisme, joint à d’autres fragments d’ADN, et mis dans une bactérie ou d’autres organismes. Dans un autre exemple du génie génétique un fragment d’ADN, souvent un gène entier, peut être isolé et sa séquence nucléotidique déterminée ou sa séquence nucléotidique peut être altérée par des méthodes mutagènes in vitro. Ces activités connexes en génie génétique ont deux objectifs fondamentaux :
1) pour en apprendre davantage sur les œuvres de la nature.
2) trouver les moyens de faire usage de ces connaissances à des fins pratiques.
L’isolement du phage spécialisé de transduction qui portait les gènes de l’opéron lac a été une avancée particulièrement importante, car ces phages ont fourni un enrichissement de plus de 100 fois des gènes lac par rapport à l’ADN chromosomique. Il a également stimulé une grande variété d’études importantes qui ont favorisé grandement notre compréhension de la régulation des gènes ainsi que favorisé le développement de nombreuses techniques de génie génétique importantes. Maintenant le génie génétique permet les mêmes sortes d’études à effectuer sur un gène à partir de pratiquement tout organisme.

La deuxième raison majeure de l’intérêt du génie génétique est la synthèse économique de protéines, difficiles ou impossibles à purifier à partir de leurs sources naturelles. Ces protéines peuvent être des antigènes pour une utilisation dans l’immunisation, les enzymes pour une utilisation dans les procédés chimiques ou des protéines spécialisées à des fins thérapeutiques. Les séquences d’ADN cloné peuvent également être utilisées pour la détection des défauts chromosomiques et dans des études génétiques. Beaucoup de recherches en génie génétique ont également été réalisées dans les usines avec l’espoir d’améliorer les méthodes génétiques traditionnelles de modification des cultures. Un second objectif est l’introduction de la résistance aux herbicides dans les cultures souhaitées. Cela permettrait la pulvérisation contre les mauvaises herbes dans les champs même pendant la croissance au lieu de le faire avant la plantation. Le génie génétique de l’ADN implique généralement les étapes suivantes :
1) L’ADN pour l’étude doit être isolé et libéré des contaminants. Il doit être possible de couper cet ADN à des endroits spécifiques afin de produire des fragments contenant des gènes ou parties de gènes.
2) Ensuite il doit être possible de rejoindre les fragments d’ADN pour former des molécules d’ADN hybrides.
3) Les vecteurs doivent exister pour que les fragments assemblés puissent être introduits dans des cellules par le procédé appelé transformation.
4) Les vecteurs doivent avoir deux propriétés. Tout d’abord ils doivent fournir l’ADN autonome du vecteur pour la réplication dans les cellules et, d’autre part, ils doivent permettre une croissance sélective des seules cellules qui ont reçu les vecteurs.
Ce chapitre décrit les étapes fondamentales du génie génétique ainsi que la technique essentielle de la détermination de la séquence nucléotidique d’un fragment d’ADN

L’isolement de l’ADN :

L’ADN cellulaire, chromosomique ou non chromosomique, est le point de départ de nombreux expériences de génie génétique. Un tel ADN peut être extrait et purifié par les techniques classiques de chauffage des extraits cellulaires en présence de détergents et après élimination des protéines par extraction au phénol. Si des polysaccharides ou des ARN contaminent l’échantillon ils peuvent être éliminés par centrifugation à gradient de densité d’équilibre au chlorure de césium. Deux types de vecteurs sont communément utilisés : des plasmides et des phages. Un plasmide est un élément d’ADN semblable à un épisome qui se reproduit de manière indépendante du chromosome. Habituellement les plasmides sont de petites tailles, 3000 à 25.000 paires de bases et circulaire.

En général, le phage lambda ou des dérivés apparentés sont utilisés comme vecteur pour des Escherichia coli, mais pour clonage dans d’autres bactéries, comme Bacillus subtilis, d’autres phages sont utilisés. Dans certains cas un plasmide peut être développé qui se réplique de façon autonome en dehors de plus d’un organisme hôte. Ces vecteurs « navettes » sont importants dans l’étude des gènes des eucaryotes, nous allons les examiner plus tard. Le plus souvent la purification complète de l’ADN de plasmide est inutile et l’ADN utilisable peut être obtenu simplement par la lyse des cellules en éliminant partiellement l’ADN chromosomique et la plupart des protéines. Les constructions complexes d’ADN nécessitent souvent l’ADN très pur pour éviter l’interférence des nucléases exogènes ou l’inhibition des enzymes sensibles.

L’isolement de l’ADN plasmidique :

La purification complète de l’ADN plasmidique nécessite généralement plusieurs étapes. Après que les cellules sont ouvertes avec le lysozyme qui digère la paroi cellulaire et que les détergents sont ajoutés pour solubiliser les membranes et  inactiver certaines protéines, la plupart des ADN chromosomiques sont éliminés par centrifugation. Pour de nombreux objectifs des méthodes chromatographiques peuvent être utilisées pour effectuer la purification. Lorsque la pureté la plus élevée est nécessaire le plasmide est purifié par la densité d’équilibre de centrifugation à gradient. Cela se fait en présence de bromure d’éthidium. Tout ADN chromosomique restant avec le plasmide aurait été fragmenté et sera linéaire, alors que la plupart des ADN plasmidique seront circulaires car liés de manière covalente. Comme nous l’avons vu précédemment  l’intercalation de bromure d’éthidium détord l’ADN.

Pour une molécule circulaire cette détorsion génère sur-enroulement alors que pour une molécule linéaire la détorsion n’a pas d’effets majeurs. Par conséquent un ADN linéaire peut intercaler plus du bromure d’éthidium qu’une molécule circulaire. Etant donné que le bromure d’éthidium est moins dense que l’ADN, les molécules d’ADN linéaires intercalées avec bromure d’éthidium « flottent » par rapport à l’ADN circulaire et donc les deux espèces peuvent facilement être séparées. Suivant la centrifugation, les deux bandes d’ADN sont observées par les UV éclairant la lumière du tube. La fluorescence naturelle du bromure d’éthidium est augmentée de 50 fois par intercalation dans l’ADN et le Phage lambda peut également être partiellement purifié par des techniques rapides et éliminer les débris cellulaires et la plupart des contaminants. Une purification plus complète peut être obtenue en utilisant leur densité unique de 1,5 g/cm3, qui est à mi-chemin entre la masse volumique de protéines, de 1,3 et la densité de l’ADN, 1.7. Le phage peut être isolé par la centrifugation à gradient de densité d’équilibre dans laquelle la densité à mi-chemin entre le haut et le bas du tube de centrifugation est de 1,5. Eux aussi peuvent être facilement observés dans la centrifugeuse. Ils forment une bande bleue qui résulte de la dispersion préférentielle des longueurs d’onde plus courtes de la lumière connue sous le nom d’effet Tyndall. Ce même phénomène est la raison pour laquelle le ciel est bleu et les couchers de soleil sont rouges.

La biologie des enzymes de restriction :

Dans cette section, nous allons d’abord voir la biologie des enzymes de restriction et puis revenir à leur utilisation pour couper l’ADN. On a maintenant trouvé un grand nombre d’enzymes qui coupent l’ADN à des endroits spécifiques. Pour la plupart ces enzymes proviennent de bactéries. Elles sont appelées des enzymes de restriction parce que, dans les quelques cas qui ont été soigneusement étudiés, le clivage enzymatique de l’ADN fait partie du système de restriction-modification de la cellule. Le phénomène de restriction-modification des bactéries est un système immunitaire à une petite échelle pour une protection contre l’infection par l’ADN étranger. Contrairement à des organismes supérieurs dans lesquels l’identification et l’inactivation de l’invasion des parasites, des bactéries ou des virus peuvent être effectuées de manière extracellulaire, les bactéries peuvent se protéger après que l’ADN étranger est entré dans leur cytoplasme. Pour cette protection de nombreuses bactéries marquent spécifiquement leur propre ADN par la méthylation des bases sur des séquences particulières avec des enzymes de modification. L’ADN qui est reconnu comme étranger par l’absence de groupes méthyle sur ces mêmes séquences est clivé par les enzymes de restriction puis dégradé par les exonucléases aux nucléotides. Moins d’un phage sur 10000 sont erronément méthylés et sont capables de croître et de lyser un E.coli protégé par certains systèmes de modification-restriction. En outre les bactéries se protègent de l’ADN végétal et animal. L’ADN de beaucoup d’ animaux et de végétaux est méthylé sur la cytosine dans les séquences CpG. Beaucoup de souches de bactéries contiennent également des enzymes qui clivent l’ADN lorsqu’il est méthylé sur des positions spécifiques.

Arber a étudié la restriction du phage lambda dans E. coli et a constaté que La souche E. coli C ne contenait pas de système de modification-restriction. Souche B a un système de modification-restriction, et pourtant un autre reconnaît et méthyle une séquence nucléotidique différente dans la souche K-12. Phage P1 possède un système de modification- restriction propre à elle même qui est superposable au système de restriction-modification de l’hôte dans lequel elle est un lysogène.
Soit la notation λ-C représente la croissance de phage lambda qui a été cultivé sur La souche E. coli C. L’infection des souches B, K-12, et C avec λ sur diverses souches va se faire à différentes vitesses :

La possession d’un système de modification-restriction introduit des complexités dans le processus de replication de l’ADN. Imaginez que le double brin d’ADN contient des groupes méthyle sur les deux brins de l’ADN au niveau d’une séquence de reconnaissance. la réplication de l’ADN crée un duplex dans lequel l’un des brins des duplexes fille dans un premier temps n’a pas été modifié .
Cet ADN demi-méthylé ne doit pas être reconnu comme un ADN étranger et clivé, mais doit être reconnu comme «soi» et méthylé.

Par conséquent, le système de restriction- modification fonctionne comme un micro-ordinateur, reconnaissant les trois états différents de la séquence de reconnaissance il réagit de trois  manières différentes :
1) Si la séquence n’ est pas méthylé, les enzymes la clivent.
2) Si l’ADN est méthylé sur l’un des deux brins, le système de modification méthyl l’autre brin.
3) si l’ADN est méthylé sur les deux brins, les enzymes ne font rien.
Une séquence de reconnaissance palindromique simplifie le fonctionnement du système de modification-restriction. Un palindrome est une séquence qui se lit de la meme manière de gauche à droite et de droite à gauche, comme les mots « REPAPER et RADAR ». Comme les brins d’ADN possèdent une direction, on considère une séquence d’ADN à palindrome si elle est identique à la lecture de 5 ‘à 3’ sur le brin supérieur et le brin inférieur . les Palindromes, peuvent être de toutes tailles, mais la plupart de ceux qui sont utilisés en tant que séquences de reconnaissance de modification-restriction sont quatre, cinq, six, et rarement, huit bases. En vertu des propriétés de palindromes, les deux filles de palindromes répliquées ont des séquences identiques, et donc l’enzyme de modification doit reconnaître et méthyler un seul type de substrat (Fig. 9.4).

 
Comme nous l’avons déjà vu précédemment pour la reconnaissance des séquences non palindromic, il faudrait que l’enzyme de modification reconnaîsse à la fois les deux séquences différentes. On peut supposer que les protéines dimères sont utilisés pour les reconnaître. Les enzymes de restriction sont divisés en trois catégories principales. les enzymes
1) Classe I : ces enzymes sont formées de 3 sous-unités (d’une sous-unité de clivage,une sous-unité de méthylation et une sous-unité de reconnaissance des séquences). Ces enzymes clivent à
des sites éloignés de leurs séquences de reconnaissance et ne seront pas discuté ici même si elles ont été les premiers à etre découvertes.
2) Classe II :les enzymes de classe II possèdent leur sous unité de reconnaissance des séquences et leur sous unités de clivage ensemble. Ils coupent près de leur séquence de reconnaissance et sont le plus utilisé dans le génie génétique.
3) classe III possèdent  3 sous-unités (la sous-unité de clivage associée à celle de reconnaissance et la sous-unité de  méthylation). Ces enzymes  coupent  près de leur site de reconnaissance.
Une enzyme de restriction dans une cellule est une bombe à retardement parce que les principes physicà-chimiques
limitent leur spécificité pour la liaison. Si une enzyme de restriction se liait à une séquence erronée, et comme une bactérie typique contient environ 4 × 1000000 de telles séquences, très probablement la séquence ne serait pas méthylé et l’enzyme pourrait cliver l’ADN et la cellule mourrerait. l’observation, cependant, est que les cellules contenant des enzymes de restriction ne meurent pas plus vite que les cellules sans enzymes de restriction. Comment, alors, est généré  la spécificité  extraordinairement grande  des enzymes de restriction ?

 La coupure d’ADN avec des enzymes de restriction :

Les enzymes de restriction fournissent un outil nécessaire pour couper des fragments de l’ADN  à partir de molécules plus grandes. Leur spécificité  permet une  très  grande sélectivité, et leur grand nombre ( plus d’une centaine de restrictions différentes), permet une trés grande  variétés  de choix des  sites de clivage utilisés. Souvent, les fragments peuvent être produits avec des points d’extrémité situés à moins de 20 paires de bases de n’importe quel emplacement souhaité.

Une des propriétés les plus utiles des enzymes de restriction pour le génie  génétique se trouve dans le système de modification-restriction produit par Plasmide R d’E.coli. L’enzyme de restriction correspondante est appelée Eco RI. Au lieu de cliver au centre de sa séquence de reconnaissance palindromique, cette enzyme coupe à l’extrémité et produit des extrémités à 4 bases complémentaires.Ces extrémités « collantes » sont les plus utiles dans la technologie de l’ADN  recombinant. Elles peuvent être re-soudés  à basse température comme les extrémités « collantes » du phage lambda. Cela permet l’assemblage efficace des fragments  de l’ADN au cours des étapes de soudures . Environ la moitié des enzymes de restriction, actuellement  connu peuvent générer des extrémités en surplomb ou collantes. Dans certaines situations, un fragment d’ADN peut même être agencé de telle manière à avoir deux types de collant différents.

L’isolement des fragments d’ADN :

Après le clivage de l’ADN par des enzymes de restriction ou d’autres manipulations (cf plus tard) les fragments d’ADN doivent souvent être isolés. Heureusement, le fractionnement en fonction de la taille est particulièrement facile parce que, comme indiqué précédemment, l’ADN possède un rapport charge sur masse  constant et les fragments d’ADN double brin de la même longueur ont la même forme et donc migrent  pendant l’électrophorèse à une vitesse pratiquement  indépendant de leur séquence. En général, plus l’ADN est grand,  plus sa vitesse de migration est lente.  Une très grande résolution peut être obtenue en électrophorèse par example deux fragments dont les tailles diffèrent de 0,5% peuvent être séparés si elles se trouvent dans une plage de 2 à 50 000 paires de bases. Une plage typique pour une séparation de taille adéquate pourrait être de 5 à 200 paires de bases ou 50 à 1000 paires de bases, et ainsi de suite. Le matériau à travers lequel l’ADN est soumis à une électrophorèse doit posséder des propriétés particulières. Il doit être peu coûteux, facilement utilisable, non chargée, et il devrait former un réseau poreux. Deux matériaux répondent aux exigences: agarose et polyacrylamide. Après l’électrophorèse, les bandes formées par les différentes tailles des fragments peuvent être localisés par autoradiographie si l’ADN avait été radiomarqué avant la séparation. Habituellement 32PO4 est une étiquette commode parce que le phosphate se trouve dans l’ARN et l’ADN, 32P émet notamment  des  électrons énergétiques qui les rend facilement détectables, et enfin 32P a une demi-vie courte de sorte que la plupart des atomes radioactifs dans un échantillon désintégreront  dans un délai raisonnable. L’isotope  33P  est également utilisé. Sa désintégration bêta est plus faible, et il a une demi-vie de 90 jours. Souvent, l’ADN est suffisamment présent et il peut être directement détecté par coloration avec éthidium bromure. La fluorescence accrue du bromure d’éthidium intercalées dans l’ADN par rapport à sa fluorescence dans la solution  permet la détection d’aussi peu que 5 ng d’ADN dans un groupe. Après la séparation par l’ électrophorèse et  la détection de l’ADN, les fragments souhaités peuvent être isolé à partir du gel.

Souder les fragments d’ADN :

Après la coupure et la purification de l’ADN nous allons discuter de l’assemblage des molécules d’ADN. In vivo, l’enzyme ADN ligase répare les entailles survenant sur la squelette de l’ADN. Cette activité peut également être utilisés in vitro pour la jonction de deux molécules d’ADN. Deux exigences doivent être respectées. D’abord, les molécules doivent être les substrats corrects, autrement dit, ils doivent posséder des groupes hydroxyle 3′- et 5′-phosphate. Ensuite les groupes sur les molécules à assembler doivent être correctement positionnés par rapport à l’autre. Le procédé pour produire le bon positionnement présente deux variantes: soit hybrider les fragments ensemble par leurs extrémités collantes complémentaires :

 

 

et, si  l’assamblage concerne des  fragments coupés avec bouts francs  , d’utiliser des concentrations  très élevées de fragments qui, de temps en temps,seront spontanément face à face avec positions correctes.De nombreuses enzymes de restriction telles que EcoRI produisent des extrémités collantes à quatre bases qui peuvent être soudées ensembles. Comme  les extrémités collantes sont généralement seulement quatre  paires de base, la baisse de la température  à environ 12 ° C, facilite le processus d’hybridation-ligature. Les extrémités franches de molécules d’ADN qui sont générés par certaines  enzymes de restriction génèrent des problèmes. Une solution consiste à convertir les bouts francs des molécules à des bouts collants par l’enzyme terminale transférase. Cette enzyme ajoute des nucléotides à l’extrémité 3′ de l’ADN. Une queue Poly-dG peut être ajouté à un fragment et une queue poly-dC peut être ajouté à l’autre et les fragments peuvent ensuite être hybridés ensemble

Si les queues sont assez longues, le complexe peut être introduit directement dans les cellules, où les lacunes et les pseudos seront remplis et scellés par le système enzymatique des cellules. Le plus souvent, la réaction en chaîne par polymerase ( PCR) serait utilisée pour générer des extrémités souhaitées sur les molécules. En outre les molécules ayant un bout franc peuvent également être soudées
par  l’ADN ligase. Bien que cette méthode est très simple, elle souffre de deux inconvénients: Elle nécessite des concentrations élevées d’ADN et de l’ADN ligase  pour que la réaction s’initie et meme dans ces conditions l’efficacité reste faible.  En outre, il est difficile d’exciser le fragment du vecteur . Les Lieurs peuvent également être utilisés pour générer des molécules  auto-complémentaires monocaténaires. Les Linkers sont des ADN  courtes avec bouts francs ,  contenant la séquence de reconnaissance d’une enzyme de restriction qui produit des extrémités cohésives. La ligature des lieurs à des fragments d’ADN se produit avec un rendement  assez haut car des concentrations molaires élevées des lieurs peuvent facilement être obtenues. Une fois que les lieurs ont été relié au segment d’ADN, le mélange est digéré avec l’enzyme de  restriction qui coupe les lieurs et génère des extrémités collantes.  Ainsi une molécule d’ADN à bout franc est converti en une molécule collante à composition non limitée qui peuvent facilement être jointes à d’autres molécules d’ADN.