Introduction
Le transfert de Southern est l’une des techniques centrales en biologie moléculaire. D’abord mis au point par E M Southern (1975), le transfert de Southern a pour résultat le transfert de molécules d’ADN, habituellement des fragments de restriction, d’un gel d’électrophorèse à une feuille de nitrocellulose ou de nylon, de telle sorte que le motif de la bande d’ADN présent dans le gel est reproduit sur la membrane. Au cours du transfert ou à la suite d’un traitement ultérieur, l’ADN devient immobilisé sur la membrane et peut être utilisé comme substrat pour l’analyse d’hybridation avec des sondes d’ADN ou d’ARN marquées ciblant spécifiquement des fragments de restriction individuels dans l’ADN transféré. Essentiellement, le transfert de Southern est donc une méthode de «détection d’un fragment de restriction spécifique sur fond de nombreux autres fragments de restriction».
L’ADN restreint pourrait être un plasmide ou un clone de bactériophage, le transfert de Southern étant utilisé pour confirmer l’identité d’un fragment cloné ou pour identifier un sous-fragment intéressant à partir de l’ADN cloné, ou d’ADN génomique. Et dans ce cas, ça sera une préparation pour des techniques telles que l’analyse du polymorphisme de la longueur des fragments de restriction.
Dans cet article, les principes généraux du transfert de Southern sont décrits, suivis d’un survol des méthodologies utilisées pour la préparation de l’ADN avant transfert, le transfert lui-même et l’analyse de l’hybridation. L’article se terminera par une étude des applications et des limites du transfert de Southern. Le principe du transfert de Southern, l’aptitude de la poudre ou des feuilles de nitrocellulose à se lier à l’ADN étaient connue depuis de nombreuses années et a été utilisée dans les années 1950 et 1960 dans divers types d’études d’hybridation d’acides nucléiques. Dans ces premières techniques, l’ADN immobilisé était non fractionné, consistant simplement en un ADN total lié à la poudre de nitrocellulose ou déposé sur une feuille de nitrocellulose. L’introduction au début des années 1970 de méthodes d’électrophorèse sur gel permettant de séparer les fragments de restriction de l’ADN en fonction de leur taille a conduit au développement de techniques de transfert en masse de fragments séparés du gel au support de nitrocellulose. La procédure décrite par Southern (1975), impliquant un transfert capillaire de l’ADN du gel vers une feuille de nitrocellulose placée au-dessus, était simple et efficace et bien qu’embellie au fil des ans, cette procédure originale diffère légèrement de la méthode de routine encore utilisée dans de nombreux laboratoires de biologie moléculaire. La méthode originale pour le transfert de Southern est illustrée sur la figure ci-dessous.
Une électrophorèse sur gel d’agarose contenant les fragments de restriction fractionnées, est placé sur une mèche de papier filtre qui forme une connexion entre le gel et un réservoir de tampon à haute teneur en sel. Une membrane est placée sur le dessus du gel et recouverte d’une tour de serviettes en papier qui sont maintenues en place avec un poids. L’action capillaire a pour effet de faire tremper le tampon dans la mèche, le gel et la membrane du papier filtre et dans les serviettes en papier. Lorsque le tampon traverse le gel, les fragments d’ADN sont transportés avec celui-ci dans la membrane, où ils sont liés à la nitrocellulose. Le transfert efficace de fragments jusqu’à 15 kb de longueur dure environ 18 h, ce qui équivaut à peu près à toute une «nuit». La seule complication de la technique est la possibilité que le tampon contourne le gel en trempant directement de la mèche vers les serviettes en papier, ce qui est peu probable si l’installation est soigneusement assemblée. Des modifications plus récentes apportées au transfert de Southern sont présentées sur le schémas ci-dessous:
L’amélioration majeure a été l’introduction de membrane en nylon, qui présente trois avantages par rapport à la membrane en nitrocellulose :
1/ Les membranes de nylon sont moins fragiles que les feuilles de nitrocellulose, ces dernières tendent à se fissurer lorsqu’elles ne sont pas manipulées avec doigté pendant le transfert de Southern et se désintègrent généralement si l’on tente d’effectuer plus de deux ou trois analyses d’hybridation avec la même feuille. Les membranes en nylon ne peuvent pas être endommagées par la manipulation et une seule membrane peut être réhybridée jusqu’à dix fois, cette limite étant due non à une rupture éventuelle de la membrane mais à la perte progressive de l’ADN transféré lors d’hybridations répétées.
2/ Le second avantage des membranes de nylon est que, dans certaines conditions (une membrane chargée positivement et un tampon de transfert alcalin), l’ADN transféré se lie de manière covalente à la membrane pendant le processus de transfert. Ce n’est pas le cas avec une membrane de nitrocellulose, qui lie initialement l’ADN de manière semi-permanente, l’immobilisation se produisant seulement lorsque la membrane est cuite à 80°C. Le transfert sur une membrane de nylon chargée positivement peut donc réduire la perte possible d’ADN qui pourrait se produire par lessivage à travers la membrane pendant le processus de transfert, il est également plus rapide, le temps de transfert étant réduit de 18 h à 2 h.
3/ Enfin, les membranes de nylon lient efficacement les fragments d’ADN jusqu’à 50 pb de longueur, alors que les membranes de nitrocellulose ne sont efficaces qu’avec des molécules de plus de 500 pb. La nitrocellulose n’a cependant pas été complètement remplacée car elle présente un avantage significatif par rapport aux membranes de nylon: une quantité réduite d’hybridation de fond, en particulier avec des sondes qui ont été marquées avec des marqueurs non radioactifs.
D’autres modifications ont été apportées à la procédure originale de transfert de Southern pour accélérer et améliorer l’efficacité du transfert. Des modifications de l’architecture du système de transfert capillaire ont été proposées, mais ces procédés alternatifs sont plus compliqués à mettre en place que le simple transfert vers le haut représenté sur la figure ci-dessus et aucun n’offre une amélioration majeure de la vitesse ou de l’efficacité. Des améliorations peuvent cependant être obtenues en utilisant une méthode de transfert non capillaire, telle qu’un électro-transfert, qui utilise une électrophorèse pour déplacer l’ADN du gel vers la membrane. Cette technique a été initialement développée pour le transfert de gels de polyacrylamide, dont les tailles de pores sont trop petites pour un transfert capillaire efficace de l’ADN, et a également été appliquée à des gels d’agarose .
L’électro-transfert est plus rapide que le transfert capillaire mais, doit être effectué avec précaution car des problèmes peuvent survenir avec la formation de bulles si le gel devient trop chaud pendant le transfert. Le Transfert sous vide est un choix plus populaire pour les gels d’agarose, une pression de vide étant utilisée pour entraîner le tampon à travers le gel et la membrane plus rapidement que par simple action capillaire, ce qui permet de réduire le temps de transfert à 30 minutes. On a également tenté de se dispenser entièrement du transfert de Southern et d’effectuer une analyse d’hybridation directement avec le gel d’électrophorèse, l’immobilisation de l’ADN étant obtenue en séchant le gel de sorte que l’ADN soit piégé dans la matrice de gel déshydratée ou lié à un support solide sur lequel le gel est placé avant le séchage. Ces techniques se sont avérées utiles pour certaines applications mais, souffrent de signaux de fond élevés après l’analyse d’hybridation.
Préparation de l’ADN avant le transfert de Southern :
Préparation de l’ ADN génomique :
Les techniques utilisées pour préparer l’ADN pour le transfert de Southern dépendent du type d’ADN étudié. Pour l’ADN génomique, l’objectif est d’obtenir des molécules qui ne sont pas devenues fragmentées de façon extensive par cisaillement aléatoire au cours du processus d’extraction, de sorte que des fragments de restriction spécifiques de 20 kb et plus puissent être obtenus. Les cellules doivent donc être brisées dans des conditions relativement douces. Pour les cellules de culture tissulaire et les échantillons sanguins, l’incubation dans un tampon contenant un détergent tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS) est généralement suffisante pour rompre les membranes cellulaires et libérer l’ADN de masse moléculaire élevée. Les bactéries, qui sont entourées par une paroi cellulaire, peuvent être cassées en douceur par traitement avec une combinaison de lysozyme et d’éthylène-diamine-tétra-acétate (EDTA).
Le lysozyme est une enzyme qui dégrade certains des composés polymères présents dans la paroi cellulaire bactérienne et l’EDTA chélate les ions magnésium qui sont requis pour l’intégrité de la structure polymère. L’addition subséquente d’un détergent provoque l’éclatement des cellules. Les cellules végétales sont généralement brisées par le broyage physique de tissus qui ont été congelés dans de l’azote liquide. Cela provoque une certaine fragmentation de l’ADN mais fournit un rendement beaucoup plus élevé. Après la rupture cellulaire, les procédures d’extraction de l’ADN génomique se poursuivent avec des étapes visant à éliminer les principaux produits biochimiques autres que l’ADN présent dans l’extrait initial. Une protéase telle que la protéinase K pourrait être incluse dans le tampon utilisé pour la rupture cellulaire, afin de commencer la dégradation des protéines dans l’extrait, mais la déprotéinisation est habituellement réalisée par extraction au phénol, addition de phénol ou mélange 1:1 du phénol et du chloroforme entraînant la précipitation des protéines. Après centrifugation, les protéines précipitées migrent vers l’interface entre les phases organique et aqueuse, tandis que les acides nucléiques restent dans la phase aqueuse.
Pour les extraits de plantes, qui contiennent des quantités plus importantes de glucides que celles trouvées dans la plupart des cellules animales et microbiennes, une purification supplémentaire impliquant le détergent bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB) est fréquemment utilisée. Ce composé se lie spécifiquement aux acides nucléiques, améliorant leur récupération lors de l’extraction du phénol. La plupart des procédures d’extraction comprennent également la digestion de l’ARN avec de la ribonucléase et un traitement final avec de l’éthanol, qui précipite les polymères d’acide nucléique restants, ce qui permet d’éliminer les ribonucléotides et autres contaminants de faibles poids moléculaires. L’ADN précipité est séché puis redissous dans de l’eau ou un tampon Tris-EDTA.
Préparation de l’ADN Plasmidique ou Phagique :
Des techniques spéciales doivent être utilisées si l’objectif est d’obtenir de l’ADN plasmidique ou celui du bactériophage à partir de clones bactériens. L’ADN plasmidique peut être obtenu par l’une quelconque des plusieurs techniques qui exploitent les différences physiques entre les plasmides et l’ADN génomique bactérien, les plasmides étant de petites molécules sur-enroulées alors que l’ADN génomique, après rupture cellulaire, est présent sous forme de longs fragments linéaires. Une méthode populaire implique le traitement de l’extrait cellulaire avec de l’alcali, qui précipite l’ADN linéaire mais laisse des plasmides super-enroulés en solution. L’ADN du bactériophage, par exemple les vecteurs recombinants l ou M13, sont habituellement obtenus directement à partir de particules de bactériophage sécrétées par des bactéries infectées, le procédé de purification étant simplifié par le fait que ces particules sont constituées uniquement d’ADN et de protéines.
Les techniques de transfert d’ADN:
Après que l’ADN purifié ait été traité avec une ou plusieurs endonucléases de restriction, il est fractionné par électrophorèse sur gel d’agarose et le gel est ensuite pré-traité avant la mise en place du transfert de Southern. Le prétraitement a deux objectifs:
Tout d’abord, il est souhaitable de briser les molécules d’ADN dans les bandes individuelles dans le gel en plus petits fragments, parce que les plus petits fragments sont transférés plus rapidement que les plus grands. Ceci est réalisé en trempant le gel dans 0,25 mol/lit de HCl pendant 30 min, ce qui entraîne une petite quantité de dépurination – clivage de la liaison bN-glycosidique entre les bases puriques (adénine ou guanine) et le composant sucre de leurs nucléotides – qui est suivie par la décomposition de la structure du sucre et la rupture de la chaîne polynucléotidique.
Le deuxième prétraitement est avec une solution alcaline qui dénature les molécules d’ADN double brin par rupture de leurs liaisons hydrogène, de sorte que les molécules deviennent simple brin. Cela facilite leur transfert et leur liaison subséquente à la membrane, et garantit également qu’après la liaison, les composants d’appariement de bases des polynucléotides sont disponibles pour l’hybridation avec la sonde. Si une membrane de nitrocellulose est utilisée, le prétraitement alcalin est suivi d’une neutralisation du gel par trempage dans un tampon Tris-sel, cette étape étant essentielle car l’ADN ne se lie pas à la nitrocellulose à un pH supérieur à 9,0. Le transfert de Southern est ensuite mis en place, comme illustré sur la figure 1, avec un tampon de transfert à haute teneur en sel, habituellement la formulation appelée ’20x SSC ‘, qui comprend 
(sel) et 0,3 mol de citrate de sodium 
. Le même tampon peut être utilisé pour le transfert sur une membrane de nylon, mais avec une membrane de nylon chargée positivement, un tampon de transfert alcalin 
est utilisé car, comme décrit précédemment, ceci entraîne une fixation covalente immédiate de l’ADN transféré à la membrane. Avec ce type de transfert, le prétraitement alcalin est inutile. Le transfert est ensuite laissé pendant au moins 18 heures pour un transfert à teneur élevée en sel, ou 2 heures pour un transfert alcalin. Après le transfert, le montage de transfert est démonté et la membrane est rincée à 2x SSC et laissé sécher. Si la tache a été faite sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon non chargée, alors l’ADN n’est que faiblement lié à la membrane à ce stade. Une immobilisation plus permanente doit donc être réalisée soit par cuisson à 80°C pendant 2 h, ce qui entraîne une fixation non covalente mais semi-permanente de l’ADN sur une membrane de nitrocellulose, soit une irradiation UV qui entraîne une fixation covalente de l’ADN sur une membrane de nylon.
Hybridation d’ADN/ADN:
L’analyse d’hybridation est basée sur le principe que deux polynucléotides formeront un hybride stable par appariement de bases si leurs séquences nucléotidiques sont totalement ou partiellement complémentaires. Un fragment de restriction spécifique dans un transfert de Southern peut donc être détecté si la membrane est sondée avec une seconde molécule d’ADN marquée qui a la même séquence, ou une séquence similaire, que le fragment recherché. Nous étudierons les types de sondes d’hybridation qui peuvent être utilisées plus tard; Nous allons d’abord étudier la méthodologie utilisée pour l’analyse d’hybridation.
Préhybridation d’un transfert de Southern:
L’analyse d’hybridation est effectuée en trempant le Southern blot dans un tampon contenant la sonde d’hybridation, habituellement dans un tube qui est constamment tourné de sorte que toutes les parties de la membrane sont exposées à la sonde, ou alternativement dans un sac en plastique scellé et placé sur un agitateur. L’hybridation est réalisée en deux étapes:
1/ Premièrement, la membrane est préhybridée dans une solution conçue pour bloquer les sites de liaison d’ADN non utilisés sur la surface de la membrane. Si cette étape est omise alors la sonde se liera de manière non spécifique à la surface de la membrane et le signal résultant de l’hybridation au fragment de restriction spécifique sera difficile sinon impossible à identifier. La solution de préhybridation contient donc des composés polymères non biologiques tels que la polyvinylpyrrolidone et/ou des polymères biologiques tels que le Ficoll (composé à base de carbohydrate), la sérumalbumine bovine ou le lait en poudre. L’ADN d’un organisme non apparenté à celui dont l’ADN va être hybridé peut également être utilisé (l’ADN du sperme de saumon est un choix populaire). La préhybridation prend entre 15 min et 3 h à 688C, selon le type de membrane.
The hybridization and washing steps :
2/ La deuxième étape est l’hybridation réelle, qui est effectuée dans un tampon riche en sel contenant un détergent, généralement 2 x SSC + 1% SDS. Deux problèmes sont critiques à ce stade de l’expérience. D’abord, suffisamment d’ADN sonde doit s’hybrider au fragment de restriction cible pour produire un signal clair qui peut être discerné par le système de détection approprié pour le marqueur porté par la sonde. Pour les applications les plus exigeantes comme la détection d’un gène simple copie dans l’ADN génomique humain, atteindre une sensibilité suffisante pourrait poser problème même si la quantité maximale d’ADN génomique est chargée sur le gel d’électrophorèse (en pratique, environ 10 µg d’ADN par voie ) et la sonde a été marquée à son activité spécifique maximale (> 1000000000 dpm/µg pour un marqueur radioactif P32). Des problèmes de plus en plus grands seront rencontrés si un élément radioactif autre que P32 est utilisée, comme S35, qui est généralement appropriée seulement pour sonder des ADN moins complexes tels que des clones plasmidiques ou bactériophages restreints, ou si une sonde non radioactive est utilisée. Dans ces circonstances, une certaine augmentation de la sensibilité peut être obtenue en incluant un polymère inerte tel que 10% de sulfate de dextrane ou 8% de polyéthylèneglycol 6000 dans la solution d’hybridation. On pense que ces polymères induisent les molécules de sonde à former des réseaux de sorte que de plus grandes quantités d’ADN s’hybrident aux sites cibles sur la membrane. En pratique, une augmentation de sensibilité de 10 à 100 fois peut être obtenue (Amasino, 1986). Le deuxième facteur critique à prendre en compte lors de l’étape d’hybridation est la spécificité de la réaction. Si l’ADN sonde a été soigneusement choisi, il contiendra une région qui est complètement complémentaire de tout ou partie du fragment de restriction recherché. Si cette région d’hybridation dans la sonde n’est pas complètement complémentaire de la cible, alors elle aura au moins une région de forte similarité de sorte qu’un hybride stable puisse se former. Le problème est que la sonde a également le potentiel de s’hybrider à tout autre fragment d’ADN transféré avec lequel elle présente une complémentarité partielle.
L’expérience d’hybridation ne donnera jamais un signal non ambigu si la sonde est plus proche d’un second fragment de restriction que de celui recherché, mais des problèmes d’hybridation non spécifique peuvent toujours survenir même si la meilleure correspondance est avec la cible spécifique. Cela signifie que l’étape d’hybridation doit être effectuée à une rigueur qui entraîne la stabilité de l’hybride sonde-cible spécifique alors que tous les autres hybrides sont instables, la rigueur étant déterminée par la composition du tampon d’hybridation et la température à laquelle l’expérience est réalisée. La composition du tampon est pertinente car la stabilité de l’hybride dépend de la force ionique et de la présence d’agents déstabilisants, tels que le formamide, qui perturbent les liaisons hydrogène. La température est pertinente parce que la température de fusion ( la température la plus élevée à laquelle l’hybride est stable) d’un hybride base-base complètement formé est plus élevée que celle pour certaines paires de bases qui ne sont pas complètement formées parce que la sonde et les ADN cibles ne sont pas totalement complémentaires. La formation de l’hybride désiré, et la déstabilisation d’hybrides non spécifiques, peuvent donc être réalisées en utilisant une combinaison appropriée de composition de tampon et de température d’hybridation. Un certain nombre de stratégies différentes sont possibles. Si la sonde a une longueur de 4100 bp, par exemple avec un fragment de restriction clonée, l’hybridation initiale est habituellement réalisée à 688 °C dans un tampon à haute teneur en sel, ce qui représente des conditions très strictes dans lesquelles seuls des hybrides stables peuvent se former avec très peu ou pas d’hybridation non spécifique. Avec cette stratégie, les étapes de lavage qui sont effectuées après hybridation sont conçues simplement pour retirer la sonde non hybridée.
Cependant, si une courte sonde oligonucléotidique est utilisée (15-25 nucléotides de longueur), alors l’étape d’hybridation est habituellement effectuée dans des conditions de rigueur faible (typiquement à une température de plusieurs degrés inférieure à la Tm calculée pour l’hybride désiré). Tous les hybrides potentiels, y compris les hybrides non spécifiques, sont capables de se former. La spécificité est ensuite atteinte par une série de lavages à des températures croissantes, de sorte que, espérons-le, seul l’hybride désiré reste à la fin de la procédure. Après lavage, la membrane est soumise à la procédure de détection appropriée à la sonde utilisée, par exemple autoradiographie pour une sonde radioactive. Une ré-observation subséquente est possible si la membrane est « retirée » par lavage dans un tampon à haute température contenant un alcali et un détergent pour déstabiliser l’ADN hybridé. Cette procédure n’est jamais entièrement satisfaisante car il est difficile d’éviter d’enlever une partie de l’ADN en même temps, de sorte que même les membranes de nylon portant un ADN lié de manière covalente ne peuvent être réprimées qu’une dizaine de fois.
Les types de sondes d’hybridation:
Any DNA molecule that is complementary to the restriction fragment being sought can be used as the probe. Depending on the application (see below),the probe might itself be a restriction fragment,or it might be a DNA molecule obtained by the polymerase chain reaction (PCR),or a cDNA prepared by complementary DNA synthesis from an mRNA template. Synthetic oligonucleotides are also frequently used as hybridization probes, especially when discrimination between very similar target DNAs is required. This is because oligonucleotides of 15– 25 nucleotides in length form hybrids whose melting temperatures can be estimated from the formula: Tm 5 (2 number of A and T nucleotides) 1 (4 number of G and C nucleotides) 8C The Tm values for most 15–25mer oligonucleotides fall between 40 and 908C. A single nonbase-paired nucleotide position in the hybrid between the oligonucleotide probe and target DNA can reduce the Tm by 3–58C,so careful control of the posthybridization wash temperature can distinguish a target site that is completely complementary to the probe from one that differs at just a single nucleotide position,enabling highly specific probing to be carried out. A second popular type of hybridization probe is one made of RNA rather than DNA. RNA probes have a number of advantages compared with their DNA counterparts,the most important of which in practical terms is the availability of methods for synthesis in the test tube of large amounts of an RNA probe from a DNA molecule that has been cloned adjacent to a promoter for a bacteriophage RNA polymerase. Starting with 1 mg of cloned DNA, purified T7 RNA polymerase,for example,can make up to 30 mg of RNA in 30 min,this RNA being labelled with a specific activity of over 109 dpm mg 2 1 if a 32P-labelled ribonucleotide is included in the reaction mixture. RNA probes also have the advantage of being single-stranded, which means that the effective probe concentration does not decline during the hybridization,as happens with a double-stranded DNA probe due to base-pairing of the two complementary probe molecules to one another.
Applications and Limitations of Southern Blotting
The applications of Southern blotting are diverse and are not easily summarized in a short article. Two examples will suffice to illustrate the range of research questions to which the technique can be applied.
Southern blotting in clone identification
The commonest applications of Southern blotting occur during projects aimed at identification and cloning of a specified gene. Southern blotting of genomic DNA is used to identify one or more restriction fragments that contain the gene being sought and,after cloning and tentative identification of the desired recombinant by colony or plaque hybridization probing,Southern blotting of restricted clone DNA is used to confirm the clone identification and possibly to locate a shorter restriction fragment, containing the sequence of interest,from within the cloned DNA. The latter application is important because the interesting gene sequence might be just a few kb in length but contained initially in a genomic clone of several hundred kb prepared with a high-capacity vector such as a bacterial or yeast artificial chromosome. For Southern blotting to be applicable to gene identification it is of course necessary to have a suitable hybridization probe,one that will detect specifically the one or more restriction fragments that contain the gene being sought. Often the gene will have already been cloned as a cDNA that can be used as a probe for identification of the genomic version of the gene. Alternatively,if the gene has been cloned from a related organism,one in which the gene sequence is likely to be similar to that in the organism now being studied, then heterologous probing can be used,in which some noncomplementarity between probe and target is tolerated during the hybridization step. This approach can be used, for example,to identify homologues of human genes in the genomes of other primates,and can even be used across broad species barriers,for example by using Drosophila genes as probes for related human sequences. Another possibility is to use the amino acid sequence of the protein coded by the desired gene to design a mixed oligonucleotide probe,one that consists of a variety of related sequences that together include all the combinations that would code for a short segment of the amino acid sequence. For example,the mixed oligonucleotide 5’-AA(C/U)GA(A/ G)AUGUU(C/U)UGGUA(C/U)GG-3’,which contains sixteen different sequences,covers all possibilities for the amino acid sequence asparagine-glutamine-methioninephenylalanine-tryptophan-tyrosine-glycine and would be expected to detect the DNA sequence coding for this protein segment when used at a sufficiently high stringency in a Southern hybridization experiment. Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net 5
Restriction fragment length polymorphism analysis
The second major application of Southern hybridization is in the technique called restriction fragment length polymorphism (RFLP) mapping,which is important in construction of genome maps (Brown,1999). Treatment of genomic DNA from different individuals with a single restriction enzyme does not always give the same set of fragments because some restriction sites are polymorphic, being present in some individuals but absent in others, usually because a point change in the nucleotide sequence changes the restriction site into a sequence not recognized by the restriction enzyme. These polymorphic sites can be used as markers in genetic mapping and were of considerable importance in construction of the first comprehensive human maps (Donis-Keller et al.,1987),there being about 105 RFLPs in the human genome. RFLPs are typed by Southern blotting as shown in Figure 2,the probe being a DNA fragment that spans the polymorphic region (possibly one of the polymorphic fragments,possibly a fragment prepared by cutting the DNA with a different restriction enzyme,or possibly a fragment obtained by PCR) and the presence or absence of the polymorphic site determined from the size(s) of the restriction fragment(s) detected after Southern blotting.
Summary
Southern blotting is a technique that enables a specific restriction fragment to be detected against a background of many other restriction fragments. It involves transfer of DNA fragments from an electrophoresis gel to a nitrocellulose or nylon membrane in such a way that the DNA banding pattern present in the gel is reproduced on the membrane. Hybridization probing is then used to detect the restriction fragment that is being sought. The basic methodology for Southern blotting has not changed since the original technique was described in 1975,but modifications have been introduced with the aim of speeding up the process and achieving a more efficient transfer. Southern blotting has many applications in molecular biology, including the identification of one or more restriction fragments that contain a gene or other DNA sequence of interest,and in the detection of RFLPs used in construction of genomic maps.